不同干燥方式枸杞子的識別

劉旭霞 楊志剛劉建飛鞏 媛王茂鶴邸多隆*

(1.甘肅中醫藥大學藥學院,甘肅 蘭州 730000;2.中國科學院蘭州化學物理研究所,中國科學院西北特色植物資源化學重點實驗室,甘肅省天然藥物重點實驗室,甘肅 蘭州 730000;3.蘭州大學藥學院,甘肅蘭州 730000)

枸杞子為茄科植物寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實[1],是一種藥食兩用中藥材,具有抗氧化、抗阿爾茨海默病、降血糖、抗腫瘤、神經保護等多種活性[2-5],由于鮮品含水量、含糖量較高,容易在儲藏過程中發霉變質,而干燥可除去其水分,抑制微生物生長,從而延長儲藏時間[6]。文獻報道的干燥方式有自然干燥、熱風對流干燥、冷凍干燥、真空干燥、超聲波干燥、膨化干燥、滲透干燥等[7],但不同手段會造成枸杞子化學成分有所差異,導致其質量有差別,曲云卿等[8]印證了這一點。

脫蠟處理是一種損壞蠟質層、加快水分排出的方法[9-10],雖然非脫蠟枸杞子外果皮表面依然有蠟質層保護,但如果脫蠟過度會導致其內部糖分受熱融化,隨著水分遷移至樣品表面,從而影響藥材品質[11]。本實驗建立了15 批枸杞子的HPLC 指紋圖譜,考察了自然晾干、設備干燥(均經1% Na2CO3脫蠟處理)、非脫蠟干燥對藥材品質的影響,以期為其質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 型高效液相色譜儀(美國Agilent Technologies 公司),配置G1312A 恒流泵、G1315B 檢測器、G1328B 手動進樣器、Agilent Chemstation software 工作站；AT-950 型柱溫箱(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；KQ-250DE 型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；BSA224S-CW 型電子分析天平(萬分之一,北京賽多利斯儀器系統有限公司)；XQ100 g 型多功能高速粉碎機(上海廣沙工貿有限公司)；DHG-9140A 型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；飛鴿牌高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；SHB-Ⅳ型雙循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)。

1.2 試劑與藥物 15 批枸杞子均為寧夏中寧產區種植的寧杞7 號品種,經甘肅中醫藥大學晉玲教授鑒定為寧夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果實,具體見表1。乙腈為色譜純(美國Mreda Technology Inc.)；冰乙酸為色譜純(天津市大茂化學試劑廠)；水為純凈水(杭州娃哈哈集團有限公司)。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 藥材粉碎后過2 號篩。精密稱取3.0 g 粉末于250 mL 錐形瓶中,加15 倍量水,60 ℃下超聲提取30 min,提取液離心(10 000 r/min) 20 min,轉移至50 mL 量瓶中加水定容,搖勻,過0.22 μm 微孔濾膜,取續濾液,即得。

2.2 色譜條件 依利特 Sepherisorb ODS2 色譜柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相0.2%冰乙酸(A) -乙腈(B),梯度洗脫(0～60 min,95%～75%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波 長310 nm；進 樣 量20 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取供試品溶液(ND1-1),在“2.2”項色譜條件下進樣測定5 次,以峰面積穩定、峰形良好、保留時間適宜的20 號色譜峰為參照峰,計算其余色譜峰相對保留時間RSD 為0.12%～2.08%,相對峰面積RSD 為0.37%～3.68%,表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液(ND1-1),于0、2、4、6、8、24 h 在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,測得共有峰相對保留時間RSD 為0.37%～2.35%,相對峰面積RSD 為0.33%～4.66%,表明溶液在24 h 內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一供試品(ND1-1) 5 份,按“2.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,測得共有峰相對保留時間RSD 為0.02%～1.51%,相對峰面積RSD 為0.96%～4.89%,表明該方法重復性良好。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立 稱取15 批藥材粉末,按“2.1” 項下方法制備供試品溶液,在“2.2” 項色譜條件下進樣測定,將上述數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 版) ”,以ND1-1、ED1-1、W1-1 為參照譜圖,生成不同干燥方式下共有模式,再將其導入相同軟件中,以自然晾干樣品共有模式為參照譜圖,采用平均數相關系數法進行多點校正,時間窗寬度為0.3 s,進行自動匹配,建立共有模式[12],共確定35 個共有峰,見圖1～2。由圖1 可知,不同干燥方式下樣品雖然色譜峰數量均一致,但其峰面積及峰高存在顯著差異,即其質量有所不同。

圖1 不同干燥方式下樣品標準指紋圖譜

圖2 樣品對照指紋圖譜

然后,將上述數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 版) ” 進行相似度評價,結果見表2,可知不同批次樣品之間的相似度均大于0.900,說明同一干燥方式下樣品整體一致無差異。再以自然晾干樣品對照指紋圖譜為參照,計算不同干燥方式下的相似度,結果見表3,可知相似度為0.759～0.997,表明不同干燥方式下樣品成分組成相同,但含有量有差異,其中設備干燥、自然晾干樣品相似度均大于0.900,而非脫蠟干燥樣品僅為0.759,表明該方式可能會對其質量產生影響。

表2 相同干燥方式下相似度測定結果

表3 不同干燥方式下相似度測定結果

2.5 化學計量學分析

2.5.1 聚類分析 以峰面積穩定、峰形良好、保留時間適宜的20 號色譜峰為參照峰,計算其余35 個色譜峰的相對保留時間和相對峰面積,將上述數據導入SIMCA 14.1 軟件進行聚類分析,采用Ward 法計算樣品之間的分類距離[13],結果見圖3。由此可知,3 種干燥方式下樣品各自聚為一類,并且自然干燥、設備干燥樣品又聚為一類,非脫蠟干燥樣品單獨聚為一類,與相似度分析結果一致。

圖3 樣品聚類分析圖

2.5.2 主成分分析[14]將共有峰相對峰面積數據導入SIMCA 14.1 軟件進行主成分分析,發現前2 個主成分累積貢獻率達91.4%,能代表大部分特征峰信息,再以前2 個主成分建立坐標系得到其得分圖,結果見圖4。由此可知,樣品按照不同干燥方式呈現明顯的離散,同一干燥方式下可很好地聚到一起,其中設備干燥、自然干燥樣品離的較近,表明其成分含有量相似；非脫蠟干燥樣品離的較遠,表明其成分含有量與其他兩者差異較大,與相似度分析、聚類分析結果一致。

圖4 樣品主成分分析得分圖

2.5.3 正交偏最小二乘判別分析[15-17]本實驗以各批樣品共有峰相對峰面積數據建立了正交偏最小二乘判別分析模型,其R2Y 為0.992,Q2為0.981,表明模型有較好的預測效果,再以預測成分得分值(Tp [1]) 和第1 個正交成分的得分值(To [2]) 繪制得分散點圖,結果見圖5。由此可知,不同干燥方式樣品在得分散點圖上得到明顯區分,可視化效果明顯。

2.5.4 置換檢驗 隨機打亂Y 變量的順序200 次,觀察其隨機排列模型與原始變量模型之間的差異,再對兩者R2值、Q2值繪制回歸線,結果見圖6。由圖可知,R2、Q2回歸線與縱軸的截距分別為0.337、-0.664,右邊原始模型的相關數值均大于左邊隨機排列模型的,表明模型無過擬合現象,有效可靠[14]。

圖5 樣品正交偏最小二乘判別分析得分圖

圖6 模型置換檢驗圖

3 討論

本實驗通過HPLC 指紋圖譜技術結合化學計量學方法,對不同干燥方式枸杞子進行識別。相似度分析結果顯示,設備干燥、自然晾干樣品相似度均大于0.900,而非脫蠟干燥僅為0.759,表明不同干燥方式會對藥材化學成分有較大影響,其原因可能是未脫蠟樣品表面有蠟質層保護,光敏性、熱敏性成分未受到影響,而自然晾干樣品上述2 類成分有一部分被破壞,設備干燥樣品熱敏性成分亦然[18-19]；聚類分析、主成分分析結果與相似度分析一致。利用主成分分析可以區分不同干燥方式的樣品,但是可視化效果不好,通過OPLS-DA 建立樣品識別模型,模型穩定可靠,識別率為98.1%,可以很好的鑒別不同干燥方式的樣品。本研究建立了一種不同干燥方式枸杞子的辨別模型,同時也為其他中藥材的鑒別研究提供了新的思路。