基于網絡藥理學的升血小板膠囊物質基礎及其作用機制研究

李霖楓,陳重華,李勝男,李天平

(1.四川大學華西藥學院,四川 成都 610041;2.四川大學華西醫院,四川 成都 610041)

升血小板膠囊是由國家食品藥品監督管理總局(CFDA) 批準的復方中藥制劑(國藥準字Z20025029),收載于《國家中成藥標準匯編內科氣血津液分冊》[1],由青黛、牡丹皮、連翹、仙鶴草、甘草配伍而成,方中青黛功效清熱解毒、涼血消斑,為君藥；牡丹皮功效清熱涼血、活血化瘀,為臣藥,佐以止血健脾的仙鶴草、消腫散結的連翹,使以清熱解毒、調和諸藥的甘草,諸藥合用,共奏清熱解毒、涼血止血、散瘀消斑作用。臨床研究表明,該制劑對原發性血小板減少性紫癜有十分顯著的療效,常與激素類藥物聯用,總有效率達90%以上,未見嚴重不良反應和肝腎毒性,而且長期耐受、價格低廉、口服方便,臨床廣泛使用[2-4],但其物質基礎和作用機制尚不明確,缺少相關藥理作用的系統性探索。

中藥成分組成復雜,能同時作用于體內多個靶點,通過多途徑、多層次、多機制發揮協同療效[5],但傳統藥物研究遵循“一藥、一靶、一病” 線性模式,難以有效地闡明中藥的治病機制。網絡藥理學將藥物研究模式轉變為“多成分、多靶點、多疾病”[6],是探索中藥藥效物質基礎、方劑配伍理論、藥理作用機制的新方法[7]。因此,本研究通過該方法探尋升血小板膠囊有效成分和作用靶點,通過靶蛋白互作、功能和通路富集(圖1) 系統地研究該制劑治療原發性血小板減少性紫癜的可能機制,為深入開展相關實驗及臨床研究提供參考。

圖1 升血小板膠囊作用機制研究的網絡藥理學流程圖

1 方法

1.1 成分篩選與靶點預測 通過TCMSP[8](http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、TCM Database@ Taiwan[9](http://tcm.cmu.edu.tw/) 等中草藥系統藥理平臺,以“青黛” “牡丹皮” “連翹” “仙鶴草” “甘草” 為關鍵詞檢索化學成分,結合相關文獻,收集整理各組分所含成分。口服生物利用度(Oral bioavailability,OB) 是指所給藥物進入人體循環的藥量比例,而類藥性(Drug-likeness,DL) 是指化合物與已知藥物的相似性,兩者共同反映化合物的成藥性。按照TCMSP 建議,通過該平臺自帶的條件篩選功能,以OB≥30%、DL≥0.18 為標準,篩選滿足條件的化合物。另外,不滿足上述條件但有文獻或數據支持、具有明確生物活性的化合物也確定為候選成分,以避免遺漏。再通過PubChem 數據庫 (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/),獲取候選成分的相關化學信息和PubChem CID。

Similarity ensemble approach[10](SEA)(http://sea.bkslab.org/) 是以化學結構為核心、比較靶標相似性的一種藥物靶點預測方法,將候選成分的Canonical SMILES 導入該平臺,預測其潛在靶點,選擇“Homo sapiens”、Tc≥0.7[10-11]的靶點作為候選靶點,進行后續分析。再通過Uni-Prot 蛋白數據庫(https://www.uniprot.org/),確認候選靶點的相關信息和UniProt ID。

1.2 成分-靶點網絡構建 通過Cytoscape3.7.1 軟件構建候選成分與其預測靶點之間的互作網絡,節點(nodes) 表示中藥、化合物或靶點,邊(edges) 表示兩者之間的相互作用。在網絡中,度(degree) 是指一個節點的與其他節點的連接數量,度越大,該節點的直接相關節點越多,在網絡中越重要,故本研究根據候選成分該數值的大小來確定關鍵化合物。

1.3 靶蛋白質互作網絡構建 為了解靶蛋白之間的互作關系(protein-protein interaction,PPI),將所有靶蛋白導入String 數據庫(https://string-db.org/),物種選擇“Homo sapiens”,最低互作分數設為“medium confidence”,獲取PPI 數據,再用Cytoscape3.7.1 構建預測靶點互作網絡。在網絡中,度中心性(degree centrality,DC)、介數中心性(betweenness centrality,BC)、接近中心性(closeness centrality,CC) 是判斷節點關鍵程度的重要拓撲參數,本研究通過Network Analyzer 計算網絡各個節點DC、BC、CC 以判斷節點重要性,再按照DC 進行節點排列作圖,圓點越大,顏色越亮,節點DC 越大。

1.4 GO 生物過程、KEGG 信號通路富集分析 通過String數據庫進行GO 生物過程、KEGG 信號通路富集分析,以FDR＜0.05 為限定值,對所得GO term、KEGG pathway 進行篩選。

2 結果

2.1 候選成分篩選 通過TCMSP、TCM Database@Taiwan及文獻檢索,以OB≥30%、DL≥0.18 或具有明確生物活性為篩選條件,共得到163 種候選成分。其中,青黛19 種,主要有 indirubin、indigo、qingdainone、tryptanthrin、quercetin 等(indirubin 為升血小板膠囊指標成分)；牡丹皮19 種,主要有paeoniflorin、benzoyl-paeoniflorin、paeonol、quercetin、kaempferol 等；連 翹40 種,主要有phillyrin、(-) -phillygenin、arctiin 等；仙鶴草23 種,主要有agrimol、agrimonolide、vitamin K1 等；甘草94 種,主要有liquiritigenin、glycyrol、glyasperin 等。升血小板膠囊含有大量生物堿、黃酮、有機酸、萜類、甾體類化合物,其中quercetin、isorhamnetin、β-sitosterol 為 5 種組方 藥材共 有成分,kaempferol、oleanic acid、caffeic acid 等13 個化合物在2 種以上中藥中同時存在。

2.2 候選成分潛在靶點預測 設定Tc≥0.7 為閾值,71 種候選成分預測出186 個靶點(其余92 種無滿足閾值的靶點)。其中,青黛12 種成分匹配到80 個靶點,牡丹皮12種成分匹配到93 個靶點,連翹29 種成分匹配到131 個靶點,仙鶴草16 種成分匹配到136 個靶點,甘草32 種成分匹配到123 個靶點。

2.3 候選成分-靶點網絡分析 將5 種組方藥材163 種候選成分、186 個潛在靶點導入Cytoscape3.7.1 中,構建成分-靶點網絡,結果見圖2,根據Network Analyzer 計算結果,網絡中含有354 個節點、744 條邊,其中549 條邊表示化合物與其潛在靶點之間的相互關系；在163 種候選成分中,有8 種度值大于20,分別是quercetin (66)、ellagic acid(43)、kaempferol (37)、myricetin (38)、luteolin (34)、apigenin (35)、isorhamnetin (26)、ferulic acid (23)；在186 個預測靶點中,有7 個度值較高,依次為CA7 (19)、CA4 (14)、CA12 (16)、AKR1B1 (13)、CA2 (11)、ABCG2 (11)、CYP1A2 (10)。由此說明,在升血小板膠囊候選成分-靶點網絡中,1 個化合物可作用于多個靶點,而1個靶點也可與多個化合物相互作用。

圖2 升血小板膠囊候選成分與潛在靶點網絡

2.4 靶蛋白互作網絡分析 通過String 平臺獲得186 個靶蛋白的互作關系,將數據文件導入cytoscape3.7.1,構建PPI (圖3),由于有8 個靶蛋白未參與蛋白互作,故網絡中實際含178 個節點、1 520 條邊,可知具有較多相互關系的靶點 有AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、ESR1、PTGS2、CCND1、MMP9、CREB1 等。根據計算結果,將DC、BC、CC 排名前20 的靶蛋白建立交集,得到AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1 等13 個三者數值均較高的潛在靶點(表1),在PPI 中均發揮關鍵作用,其中AKT1度值(87) 遠高于其余靶點,是PPI 網絡中連接其他節點的橋梁。

圖3 升血小板膠囊潛在靶蛋白互作網絡（按度中心性由大至小排序）

2.5 GO 生物過程富集分析 以FDR＜0.05 為標準,得到1 920條GO bio-progress term,主要有機體對化學物質的反應,細胞信號轉導,蛋白質的磷酸化,對酶活性、機體代謝及細胞凋亡的調控等。再按FDR 負對數值大小排序,排名前20 的GO term 見圖4,具體信息見表2。

表1 PPI 網絡關鍵靶點

圖4 GO 生物過程富集分析（排名前20）

表2 GO 生物過程富集信息（排名前20）

2.6 KEGG 通路富集分析 將186 個靶點通過String 平臺進行KEGG 通路富集分析,獲得159 條滿足FDR＜0.05 的信號通路,排名前20 的見圖5,具體信息見表3。根據KEGG pathway 數據庫分類標準,159 條信號通路可分為31類,其中癌癥通路24 條,包括前列腺癌、神經膠質瘤、膀胱癌等；信號轉導通路20 條,包括PI3K-Akt 信號通路、MAPK 信號通路、Rap1 信號通路等；感染性疾病通路19條,包括乙型肝炎、人乳頭病毒感染、麻疹等；內分泌系統通路14 條,包括孕酮介導的卵母細胞成熟、內分泌抵抗等；免疫系統通路13 條,包括B 細胞受體信號通路、T 細胞受體信號通路、Fc 受體介導的吞噬作用等。

原發性血小板減少性紫癜(ITP) 與免疫相關通路關系密切,其中Fc 受體介導的吞噬作用是KEGG 數據庫列出的ITP 病因通路。升血小板膠囊可能通過調控免疫相關通路,干預DRD2、IL2、SYK、AKT1、PIK3R1 等靶點而發揮作用,還涉及多條癌癥相關通路(如前列腺癌、PI3K-Akt 信號通路),可能具有抗腫瘤潛力。

圖5 KEGG 通路富集分析（排名前20）

表3 KEGG 信號通路富集信息（排名前20）

3 討論

原發性血小板減少性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP) 是由人體免疫功能失調所致的一種自身免疫性血液病,以血小板數量減少及壽命縮短、巨核細胞成熟障礙、皮膚黏膜、內臟出血為特征[12-13],其發病機制與抗血小板自身抗體(PAlg) 介導的血小板過度破壞或生成不足有關[14]。升血小板膠囊具有清熱解毒、涼血止血、散瘀消斑的作用,臨床上多與激素、潑尼松、白介素11 或丙種球蛋白等藥物聯用,不僅能調節機體免疫功能,還可提高血小板數量,增強血小板聚集能力[15]。曹波[16]以其聯合重組人血小板生成素注射液治療特發性血小板減少性紫癜,發現血小板恢復時間加快,血清PAlgG 水平顯著下降,臨床總有效率高達91.18%；劉婧依等[17]聯合其和花生衣提取液治療原發性血小板減少性紫癜,發現外周血中CD8+明顯降低,CD4+都明顯升高,T 細胞亞群恢復正常,血小板數量增加；何牧卿等[18]以其和潑尼松對66 名免疫性血小板減少性紫癜患者進行治療,發現臨床療效顯著高于單用潑尼松,而且外周血CD4+CD25+Treg 細胞和IL10、TGF-β1血清水平均顯著升高,表明該制劑可通過調節CD4+CD25+Treg 細胞數量或功能來參與原發性血小板減少性紫癜發病進程。

本研究通過網絡藥理學考察升血小板膠囊治療原發性血小板減少性紫癜的物質基礎和作用機制,從中獲得163種化學成分及186 個潛在作用靶點,其中槲皮素、鞣花酸、山柰酚、木犀草素、異鼠李素、β-谷甾醇等為關鍵化合物,AKT1、EGFR、TNF、SRC、HSP90AA1、PIK3R1 等13 個靶點為核心靶點。KEGG 信號通路富集結果顯示,升血小板膠囊參與多條免疫相關通路(如Fc 受體介導的吞噬作用、T 細胞受體信號通路) 和信號轉導通路 (如PI3K-Akt、MAPK 信號通路),并與PI3K-Akt 信號通路關聯度最高,涉及潛在靶點28 個,其中SRC、PIK3R1、AKT1、CREB1、HSP90AA1、SYK 等均為PPI 網絡重要靶點。由此推測,升血小板膠囊治療原發性血小板減少性紫癜的作用機制可能是(1) 阻止血小板抗體-抗原復合物與巨噬細胞膜表面的Fc 受體識別并結合,避免酪氨酸激酶活化而激活下游信號通路,防止肌動蛋白聚合和吞噬體形成,減弱巨噬細胞對血小板的吞噬作用,最終使血小板數量回升；(2) 通過干預PI3K-Akt-mTOR 通路來調控B 細胞和T 細胞的增殖、凋亡、分化[19-20],減少抗血小板自身抗體的產生 (如PAlgG),促進T 細胞亞群數量與功能的平衡(如Th 細胞、Tc 細胞、Treg 細胞),影響相關細胞因子分泌(如IL-2、IL-10、TGF-β1),與已有文獻資料基本吻合,可為后續相關研究提供參考。

由于PI3K-AKT 信號通路與腫瘤細胞的增殖、存活、凋亡及遷移等有關[21],故結合靶點預測和通路富集結果,本研究認為升血小板膠囊還可能通過調控PI3K-Akt 信號通路來發揮抗腫瘤作用,與其臨床應用和文獻資料基本契合。首先,升血小板膠囊臨床上用于治療原發性血小板減少性紫癜時,可調節免疫細胞數量與功能平衡,干預細胞免疫和體液免疫,故理論上可通過調節機體免疫功能而發揮抗腫瘤作用。其次,該制劑含有大量抗腫瘤活性物質,如青黛以靛玉紅、靛藍、青黛酮、色胺酮為主要成分,具有抗菌、抗炎、抗癌等作用和免疫調節功能,其中靛玉紅抗腫瘤活性顯著,能抑制多種癌細胞增殖[22-23]；丹皮酚是牡丹皮主要藥效成分,可通過抑制細胞增殖、誘導細胞凋亡來發揮抗腫瘤作用[24]；仙鶴草具有黃酮、有機酸、三萜等活性化合物,廣泛用于防治腫瘤,在多數處方中超劑量使用[25]；連翹、甘草可調節機體免疫功能[26-27]。但目前尚無關于升血小板膠囊治療腫瘤的報道,方中5 種中藥配伍使用是否具有上述功效仍需要通過進一步實驗進行驗證。