糖腎灌腸方聯合替米沙坦對糖尿病腎病小鼠的影響

馬 靜,郭詩韻,馮程程,盧 軍,馬 麗*

(1.新疆維吾爾自治區中醫醫院內分泌科,新疆 烏魯木齊 830000;2.新疆醫科大學,新疆 烏魯木齊 830000;3.新疆維吾爾自治區中醫醫院藥學部,新疆 烏魯木齊 830000)

糖尿病腎病是糖尿病進展到后期出現的一種嚴重并發癥,是導致終末期腎病的重要原因[1],可增加高血壓發生率和心血管疾病發生風險,并造成嚴重的社會、經濟負擔[2-3]。該疾病發生因素是多方面的,不僅包括高糖條件下醛糖還原酶、多元醇代謝、蛋白激酶C 通路的激活等,還與固有免疫與慢性炎癥反應[4]有關,其中固有免疫系統TLRs 通過激活NF-κB 信號通路來促進炎性反應[5],激活免疫細胞,分泌炎癥介質和細胞因子參與病情發生發展。近年來發現,TLR4 通過固有免疫、炎癥、足細胞損傷、腎纖維化等幾個關鍵方面介導糖尿病腎病發展[6],那么同樣作為TLRs 家族的Toll 樣受體-5 (TLR5) 也有可能是相關靶點。

糖腎灌腸方在新疆維吾爾自治區中醫醫院內分泌科臨床使用近20 年,可應用于糖尿病腎病的各臨床分期,具有改善腰膝酸困、乏力、面色晦暗、肢體浮腫、惡心、納差等癥狀,對微量蛋白尿期向臨床蛋白尿期的進展可明確干預。前期研究表明,該方可降低糖尿病腎病患者血同型半胱氨酸、內皮素水平,明確了其確切作用機制之一[7],而在應用腸道途徑延緩病程方面,不僅可降低上述2 種因子水平,還能降低尿蛋白、尿素、肌酐水平,調節血糖、血壓,改善臨床癥狀[8]。由于炎癥是糖尿病腎病發病的重要機制之一,故本實驗考察糖腎灌腸方聯合替米沙坦是否可改善炎癥,從而影響糖尿病腎病的進展。

1 材料

1.1 動物 SPF 級昆明種小鼠58 只,雌雄各半,6 周齡,體質量(20±2) g,由新疆維吾爾自治區疾控中心實驗動物中心提供,動物生產許可證號SCXK (新) 2016-0003。

1.2 藥物 糖腎灌腸方組方藥材生大黃30 g (產地甘肅,批號170504)、煅牡蠣50 g (產地山東,批號171101)、澤瀉30 g (產地四川,批號171003)、丹參15 g (產地山東,批號171005)、槐花30 g (產地河北,批號17060)、黑順片15 g (產地四川,批號171002)、黃芩30 g (產地甘肅,批號171006) 均由新疆醫科大學附屬中醫院藥劑科提供,統一煎煮后由藥理室研究人員制成浸膏。替米沙坦片(上海勃林格殷格翰藥業有限公司,批號J20150084)。

1.3 試劑 鏈脲佐菌素(北京索萊寶科技有限公司,批號614J031)；考馬斯亮藍貯備液(南京建成生物工程研究所)；拜安捷2 代血糖測定儀(上海健臻醫療科技有限責任公司)；抗TLR5 兔多抗(武漢Bio-Swamp 公司,批號PAB43755)；抗β-actin 抗體(批號ab8226)、鼠抗兔-HRP抗體(批號ab9484) (英國Abcam 公司)。

2 方法

2.1 模型建立 小鼠適應性飼養1 周后,取10 只作為正常組,喂食基礎飼料；其余小鼠均喂食高糖高脂飼料,4 周后,鏈脲佐菌素分別以60、90 mg/kg 劑量腹腔注射2次。4 d 后,小鼠斷尾取血,測定尾靜脈血糖值,以≥11.1 mmol/L 為糖尿病建模成功標準,繼續喂食高糖高脂飼料6周后收集尿液,測定尿微量白蛋白表達,以＞30 mg/dL 為糖尿病腎病建模成功標準。

2.2 分組與給藥 將造模小鼠隨機分為模型組、替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組,正常組、模型組灌胃給予生理鹽水,替米沙坦組按0.05 mL/10 g 劑量灌胃給藥,糖腎灌腸方+替米沙坦組按0.07 mL/10 g+0.05 mL/10 g 劑量灌胃給藥,每天1 次,連續4 周。

2.3 指標檢測

2.3.1 一般狀態 觀察給藥后小鼠體質量、行為學變化情況。

2.3.2 腎功能指標 分別收集小鼠尿液和血液,Hitachi7170A 型自動生化分析儀檢測血肌酐水平,考馬斯亮藍顯色法檢測尿微量白蛋白表達。

2.3.3 腎臟病理形態學 小鼠腎皮質用10%中性福爾馬林固定,乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制成3 μm 切片,HE 染色后在光鏡下觀察。冷刀片切取0.5 mm3小鼠腎組織,置于4%戊二醛固定液中,4 ℃下固定2 h,PBS 清洗3 次,1%四氧化鋨固定2 h,乙醇、丙酮梯度脫水,環氧樹脂浸透、包埋、聚合、切片,醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙重染色,在透射電鏡(TEM) 下觀察。

2.3.4 免疫組織化學 小鼠腎皮質固定,脫水,石蠟包埋,脫蠟,按免疫組化試劑盒說明書操作進行TLR5 (1∶500) 染色,在光鏡下觀察其分布。

2.3.5 TLR5 蛋白表達 采用Western blot 法。提取小鼠腸道組織總蛋白,液氮研磨,半干法電泳轉移至PVDF 膜上,5%脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗(抗TLR5 兔多抗,1∶500稀釋)、二抗(鼠抗兔-HRP 抗體,1∶500 稀釋),ECL 發光、顯影,抗β-actin 抗體(1∶500 稀釋) 作為內參,以其與β-actin 比值為TLR5 蛋白相對表達。

2.4 統計學分析 通過SPSS 17.0 軟件進行處理,計量資料先進行正態性檢驗,若符合正態分布,則組間比較采用獨立樣本t 檢驗,數據以() 表示；若不符合正態分布,則組間比較采用Wilcoxon 秩和檢驗。 P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠一般情況 在造模過程中,正常組小鼠毛色光亮,無脫毛,活動自如；模型組小鼠明顯瘦小,毛較粗糙,色澤黯淡,食物、水消耗較正常組多,喜靜少動。各組小鼠體質量見表1,可知正常組更高(P＜0.05),而其他各組之間差異無統計學意義(P＞0.05)。另外,給藥后模型組、替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠分別死亡7、8、6 只,最終納入37 只進行后續研究。

表1 糖腎灌腸方對小鼠體質量的影響（）

表1 糖腎灌腸方對小鼠體質量的影響（）

注:與模型組比較,△P＜0.05。

3.2 血肌酐水平、尿微量白蛋白表達 與正常組比較,模型組血肌酐水平、尿微量白蛋白表達升高(P＜0.01)；與模型組比較,替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組兩者降低(P＜0.01),其中糖腎灌腸方+替米沙坦組降低程度更明顯,但差異無統計學意義(P＞0.05),見表2。

表2 糖腎灌腸方對血肌酐水平、尿微量白蛋白表達的影響（）

表2 糖腎灌腸方對血肌酐水平、尿微量白蛋白表達的影響（）

注:與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,△△P＜0.01。

3.3 HE 染色 圖1 顯示,正常組小鼠腎小球毛細血管袢開放良好,腎小球毛細血管壁薄而纖細,血管袢外被足細胞,腎小囊壁完整、纖細；模型組小鼠腎小球體積增大,腎小球細胞增多,毛細血管袢開放尚可,管壁僵硬,足細胞減少,腎小囊壁完整；替米沙坦組小鼠腎小球體積稍大,腎小球細胞增多,毛細血管袢開放尚可,管壁僵硬,足細胞減少,腎小囊壁完整；糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠腎小球體積稍大,腎小球細胞增多,毛細血管袢開放尚可,管壁僵硬,足細胞減少,腎小囊壁完整。

圖1 各組小鼠HE 染色（×400）

3.4 TEM 觀察 圖2 顯示,正常組小鼠內皮細胞未見腫脹,系膜細胞未見明顯增生,周圍系膜基質無擴大,足突細胞未見異常,僅見少量足突融合。基底膜較厚；模型組小鼠系膜細胞核畸形,系膜細胞增生,足細胞核外形不規則,血管腔閉塞,系膜基質不規則,系膜內可見中等電子密度沉積物,基底膜增厚、皺縮,毛細血管皺縮；替米沙坦組小鼠系膜細胞明顯增生,系膜基質輕度增生,系膜區可見纖維增生,內皮細胞輕度腫脹,呈連拱狀改變,部分空泡樣改變,足突可見階段性融合,腎小球基底膜彌漫性增厚；糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠基底膜輕微皺縮,毛細血管袢塌陷,足突細胞階段性融合,腎小球基底膜階段性增厚。

圖2 各組小鼠TEM 圖（×8 000）

3.5 免疫組織化學 圖3 顯示,正常組小鼠TLR5 主要分布在腎小球及腎小管中,無明顯表達；模型組小鼠TLR 主要表達在近端小管的細胞質內,呈黃色顆粒,在腎小體、遠端小管內均無陽性表達；替米沙坦組小鼠TLR5 主要表達在近端小管的細胞質內,呈淺淡黃色顆粒,弱陽性表達,在腎小體和遠端小管細胞無陽性顆粒；糖腎灌腸方+替米沙坦組小鼠腎小球、腎小管細胞質中均有少量淡黃色顆粒。

3.6 TLR5 蛋白表達 與正常組比較,模型組、糖腎灌腸方+替米沙坦組TLR5 蛋白表達升高(P＜0.01),替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組之間差異無統計學意義(P＞0.05)；與模型組比較,正常組、替米沙坦組、糖腎灌腸方+替米沙坦組TLR5 蛋白表達降低(P＜0.01),見表3、圖4。

圖3 各組小鼠免疫組織化學染色（×400）

表3 糖腎灌腸方對TLR5 蛋白表達的影響（，n=5）

表3 糖腎灌腸方對TLR5 蛋白表達的影響（，n=5）

注:為方便繪制Western blot 圖,每組均取5 只小鼠。與正常組比較,**P＜0.01；與模型組比較,△△P＜0.01。

4 討論

糖尿病腎病為糖尿病主要微血管并發癥之一,是慢性高血糖所致的腎臟損害,病變累及全腎,臨床上以持續白蛋白尿、腎小球濾過率進行性下降、高血壓、水腫、貧血為主要特征,如不積極治療,則最終進展為終末期腎病[9]。因此,如何延緩糖尿病腎病進展成為目前治療的重中之重。

本實驗結果表明,替米沙坦后可降低糖尿病腎病小鼠尿微量白蛋白表達,而且在此基礎上結合糖腎灌腸方灌腸治療后肌酐、尿微量白蛋白表達也有所下降,雖然差異雖無統計學意義,但擴大樣本量后可能會更明顯地觀察到此趨勢,這與患者使用后明顯降低尿微量白蛋白的報道相符[10-11]。由此表明,糖腎灌腸方在改善糖尿病腎病進展中發揮了一定作用,而且在光鏡、電鏡下發現治療后腎小球基底膜、足突細胞改善,也能印證這一事實。

大量研究表明,炎癥、免疫反應在促進糖尿病腎病發生發展中具有重要作用,而Toll 樣受體(TLRs) 系統在激活炎性反應信號轉導通路、啟動和調節天然免疫、誘導獲得性免疫中扮演重要角色,其中TLR2、TLR4 均參與了炎癥反應[12]。近年來,Toll 樣受體-5 (TLR5) 的致炎作用也受到廣泛關注,它是機體免疫系統識別細菌鞭毛蛋白的受體,與鞭毛蛋白結合后介導機體針對病原菌的先天性免疫反應及炎癥反應,在體內外實驗中均可發現腸腔上皮細胞能產生該因子[13-14]。本研究發現,替米沙坦干預后TLR-5蛋白表達明顯下降,聯用糖腎灌腸方后其表達稍上升,可能是其余蛋白表達所致,但在靶器官腎臟中其改善程度更明顯,故推測可能通過抑制其表達來使腸道炎性反應及免疫反應明顯改變。

圖4 各組小鼠TLR5 蛋白表達

糖腎灌腸方由生大黃(后下)、煅牡蠣、丹參、黑順片(先煎)、澤瀉、生槐花、黃芩等藥材組成,方中君藥大黃具有攻積導滯、瀉火解毒、涼血化瘀、泄濁利尿等功效。佐以質重之牡礪,以斂陰潛陽。收斂固澀,化痰軟堅；與丹參、生槐花共同作用以充分吸附腸道毒素,可清除三焦壅塞濕濁之邪,蕩滌腸胃熱毒之穢,使氮質代謝產物從腸道排出,而且其“瀉而不猛”；黑順片辛溫大熱,其性善走,為通行十二經純陽之要藥,外則達皮毛而除表寒,里則達下元而溫痛冷,制約大黃寒涼之性；澤瀉氣平,味甘而淡,最善滲泄水道,專能通行小便；黃芩性清肅以除邪,味苦以燥濕,故能清熱瀉火解毒。研究表明,大黃可顯著降低糖尿病腎病大鼠血漿中尿素、肌酐水平,改善腎臟病理組織學病變,對腎臟具有明顯的保護作用[15]；黃芩中黃芩苷能降低鏈脲酶素誘導的糖尿病大鼠的血糖水平[16],而黃芩素對腎病、視網膜病變等糖尿病并發癥都有一定治療作用[17]；煅牡蠣含有大量的碳酸鈣,在收斂吸附方面起到一定作用,不但可遏制大黃瀉下太過,還能增加灌腸液的滲透壓,有利尿素、肌酐等毒性物質的排出。

中藥保留灌腸是一種傳統的中藥透析法,結腸黏膜上皮細胞的面積可達10 m2左右,較腹膜和體表面積大5 倍,加上結腸頻繁蠕動,使透析液與結腸黏膜充分接觸,加速腸腔與血液間的物質交換,使部分藥液在結腸內吸收,而部分直接發揮作用,促使毒素從腸道排出,降低血肌酐、尿素氮水平。尤其是糖尿病腎病腎功能不全的患者,因多年糖尿病導致其胃腸功能均有不同程度的損害,相關癥狀突出,加之腎功不全毒素蓄積體內,又進一步刺激胃腸引發中毒癥狀,使得服藥困難。中醫認為,肺與大腸相表里,藥物經腸道吸收后可過經脈上傳于肺,由其宣發肅降之性將藥物作用送至全身,從而發揮藥效。

綜上所述,糖腎灌腸方聯合替米沙坦對糖尿病腎病小鼠腎損傷具有保護作用,可能與下調TLR5 蛋白表達有關。但中藥具有多靶點的特點,故對糖腎灌腸方具體參與機制仍需進行深入研究。