玄黃益腎顆粒HPLC 指紋圖譜建立及3 種成分同時(shí)測(cè)定

顧東華,曾海松,黃旭驊,李 偉

(揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)江蘇龍鳳堂中藥有限公司,江蘇 泰州 225300)

玄黃益腎方是江蘇省中醫(yī)院臨床經(jīng)驗(yàn)方,用于治療糖尿病腎病,療效顯著,由鬼箭羽、地黃、黃芪、知母、牡丹皮、玄參、菟絲子、炙水蛭、澤瀉、大黃(制) 10 味藥材組成,方中鬼箭羽性寒,味苦、辛,功效清熱解毒、活血化瘀[1],可防治糖尿病腎病腎小球硬化[2-3]；水蛭性平,味咸、苦,功效活血化瘀,少量久服時(shí)化瘀而不傷正[4-6],二藥相合為君,起到清熱化瘀的作用。玄黃益腎顆粒是在對(duì)玄黃益腎方中藥材進(jìn)行提取、純化的基礎(chǔ)上制成的顆粒劑,功效益氣養(yǎng)陰活血、補(bǔ)腎疏肝健脾,本實(shí)驗(yàn)建立了該制劑HPLC 指紋圖譜,并同時(shí)測(cè)定了其中芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚的含有量[7-8],以期為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 XPE-205 型電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海) 有限公司]；KQ-250B 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Agilent 1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技公司)；Milli-Q 型超純水機(jī)(美國密理博公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動(dòng)相乙腈(A) -0.1%磷酸(B),梯度洗脫(0～2 min,5%A；2～25 min,5%～16%A；25～36 min,16%～21.5%A；36～60 min,21.5%～52.5% A)；體積流 量1 mL/min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長258 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚對(duì)照品適量,置于量瓶中,60%甲醇定容至刻度,作為貯備液,精密吸取適量,加60%甲醇制成每1 mL 分別含三者15、10、40 μg 的溶液,即得。

2.3 供試品溶液制備 取顆粒適量,研缽研細(xì)后取約0.5 g,精密稱定,置于100 mL 具塞錐形瓶中,精密加入60% 甲醇25 mL,超聲 (100 W、40 kHz) 處理 20 min,放冷至室溫,搖勻,0.45 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,即得。

2.4 HPLC 指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取顆粒(S1),按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,以2 號(hào)峰(芒果苷) 為參照,測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.37%、1.6%,表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取顆粒(S1),按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,分別于0、4、8、12、24、48 h在“2.1” 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,以2號(hào)峰(芒果苷) 為參照,測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.29%、2.3%,表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取顆粒(S1),按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,以2 號(hào)峰(芒果苷) 為參照,測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 分別小于0.54%、1.3%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 耐用性試驗(yàn) 取顆粒(S1),按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,將“2.1” 項(xiàng)下色譜條件中的柱溫、體積流量、流動(dòng)相比例、波長進(jìn)行微調(diào)后進(jìn)樣測(cè)定,同時(shí)更換儀器、色譜柱,以2 號(hào)峰(芒果苷) 為參照,測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間、相對(duì)峰面積RSD 均小于3%,表明該方法耐用性良好。

首先就體現(xiàn)在馬戴詩中多次使用楚辭的意象，如白蘋、蕙蘭、芳草、靈均、汀洲、湘水、女蘿、云中君等，借以表達(dá)自己的一片赤誠之心。如其《謁仙觀》其二云：“山空惠氣香，乳管折云房。”[5]《楚江懷古三首》其一：“云中君不降，竟夕自悲秋。”[5]借鑒屈原以美人香草喻高潔的象征手法，表明自己能超越貶謫的痛苦，淡定地對(duì)待人生的變故和仕途的挫折。

2.4.5 相似度測(cè)定及圖譜生成 取10 批顆粒,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,將色譜圖轉(zhuǎn)換為AIA 格式后導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2012.130723 版) ”,以S1 為參照,經(jīng)多點(diǎn)校正和峰匹配后采用平均值法生成對(duì)照指紋圖譜,相似度見表1,均大于0.97；指紋圖譜見圖1,可知共有10 個(gè)共有峰,其中2 號(hào)峰(芒果苷) 較高,出峰時(shí)間居中,與相鄰色譜峰分離度良好,故選擇其作為參照。

表1 10 批樣品相似度Tab.1 Similarities of ten batches of samples

圖1 10 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for ten batches of samples

2.4.6 共有峰指認(rèn)及歸屬 各藥材HPLC 色譜圖見圖2,確定2、7、10 號(hào)共有峰分別為芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚,其歸屬見表2。

圖2 各藥材HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of various medicinal materials

表2 共有峰歸屬Tab.2 Ownerships of common peaks

2.5 各成分含有量測(cè)定

2.5.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取對(duì)照品、供試品溶液適量,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,結(jié)果見圖3。由此可知,各成分理論塔板數(shù)按芒果苷計(jì)均大于6 000,色譜峰分離度均大于1.5,表明系統(tǒng)適用性符合相關(guān)要求。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.5.2 線性關(guān)系考察 精密量取“2.2”項(xiàng)下貯備液適量,60% 甲醇制成20%、50%、100%、200%、300%、400%、500% 水平的對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X),峰面積為縱坐標(biāo)(Y) 進(jìn)行回歸,結(jié)果見表3,可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表3 各成分線性關(guān)系Tab.3 Linear relationships of various constituents

2.5.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次,測(cè)得芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚峰面積RSD 分別為0.15%、0.13%、0.053%,表明儀器精密度良好。

2.5.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批顆粒 (S1),按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,另取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶 液,分別于0、4、8、12、18、24、36、48、60、72 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得2 種溶液中芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚峰面積RSD 分別為1.3%、1.5%、1.7% 和0.73%、0.76%、0.37%,表明供試品溶液在72 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批顆粒 (S1),按“2.3” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,測(cè)得芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚含有量RSD 分別為0.43%、0.45%、0.38%,表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.6 加樣回收率試驗(yàn) 取同一批顆粒(S1)(芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.747 7、0.490 9、2.081 mg/g) 9 份,平均分成3組,每份約0.25 g,精密稱定,置于具塞錐形瓶中,分別按0.5∶1、1∶1、1.5∶1 水平精密加入對(duì)照品溶液(芒果苷0.093 6、0.187 2、0.280 8 mg,金絲桃苷0.062 4、0.124 8、0.187 2 mg,丹皮酚0.250 0、0.510 0、0.765 0 mg) 25 mL,超 聲(100 W、40 kHz) 處理20 min,放冷至室溫,搖勻,經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率。結(jié)果,芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚平均加樣回收率分別為101.09%、99.90%,99.08%,RSD 分別為0.90%、0.54%、0.37%。

2.5.7 樣品含有量測(cè)定 取10 批顆粒,按“2.3” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算含有量,結(jié)果見表4。初步確定,芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚質(zhì)控范圍分別不低于0.61、0.35、1.4 mg/g (含有量均值的70%作為質(zhì)控下限)。

表4 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（mg/g，n=2）Tab.4 Results of content determination of various constituents （mg/g，n=2）

3 討論

3.1 指標(biāo)成分確定 玄黃益腎顆粒提取工藝有2條工藝路線,為了全面控制提取過程,對(duì)每條路線均設(shè)定指標(biāo)成分,其中單提藥材牡丹性微寒,味苦、辛,功效清熱涼血、活血散瘀,其主要活性成分丹皮酚具有保肝護(hù)腎、降血糖、抗菌、消炎的作用[9-10],同時(shí)還能降低低密度脂蛋白表達(dá),抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),改善血液流變性[11-12]；另1 條工藝路線中知母功效清熱瀉火、滋陰潤燥,芒果苷是其指標(biāo)成分之一,具有降糖作用[13-14],并且菟絲子功效補(bǔ)腎益精[15-16],金絲桃苷是其有效成分之一。因此,本實(shí)驗(yàn)選擇芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚作為指標(biāo)成分。

3.2 樣品前處理方法確定 本實(shí)驗(yàn)先以甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇、水為提取溶劑,色譜峰數(shù)量、信號(hào)強(qiáng)度、基線平穩(wěn)程度為指標(biāo),最終確定甲醇作為最佳提取溶劑。再考察了不同體積分?jǐn)?shù)甲醇的提取效果,最終確定為60%。然后,研究了溶劑用量、提取時(shí)間等因素,發(fā)現(xiàn)50 倍量下超聲處理20 min 即可充分提取。

3.3 色譜條件確定 本實(shí)驗(yàn)首先考察了甲醇-水、乙腈-水體系,發(fā)現(xiàn)后者基線平穩(wěn),色譜峰峰型良好,為了進(jìn)一步改善色譜峰峰形及分離度,在水中加入不同體積分?jǐn)?shù)磷酸、甲酸、乙酸、三氟乙酸,發(fā)現(xiàn)0.1%磷酸效果較理想。再采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長采集,發(fā)現(xiàn)在230 nm 處色譜峰數(shù)量最多,同時(shí)考慮到各成分色譜峰信號(hào)強(qiáng)度情況(芒果苷、金絲桃苷、丹皮酚最大吸收波長分別為258、360、274 nm),最終確定258 nm 作為檢測(cè)波長。