中藥有效成分直接作用靶點的鑒定方法及應用＊

李瑞梅，程 瑤，朱 朱，陳飛燕，戴建國，陳 琳，趙玉男

（南京中醫藥大學醫學院/整合醫學學院 南京 210023）

在藥物療效的證實或證偽中，“藥效-機制-靶點”可看做是一條“證據鏈”，其中靶點是重中之重[1]。目前，對中藥藥效和作用機制的研究相對比較成熟，但是對其靶點的探索尚處于起步階段。醫藥界對于闡釋藥物的靶點有迫切需求，中藥靶點的鑒定對其在臨床的應用和現代中藥的開發均具有重要的意義[2]。

目前，探索天然產物靶點的方法主要包括標記法和非標記法：標記法首先需標記待研究的天然產物，進而闡明它們在蛋白質組中的結合物，例如親和垂釣技術和噬菌體展示技術；由于標記天然產物費時費力，而且小分子結構的改變也可能導致非特異性結合，產生假陽性結果[3]，因而非標記法應運而生，例如：Drug Affinity Responsive Target Stability（DARTS）、Cellular Thermal Shift Assay（CETSA）、Stability of Proteins from Rates of Oxidation（SPROX）等技術。此外，還有一些基于基因組學和生物信息學的方法，預測小分子體內的作用靶點。運用這些新方法鑒定天然產物靶蛋白的同時，還應進行靶蛋白的確定及隨后的效應分析，從而構建“藥效-機制-靶點”證據鏈。

1 基于標記法對分子靶點的探索

1.1 親和垂釣技術

該方法利用生物分子之間的親和力原理，將小分子制成固相吸附劑并放置在層析柱中，將蛋白混合液倒入層析柱時，與吸附劑具有親和力的蛋白質被吸附在層析柱中，而其余沒有親和力的蛋白質不會停留，直接流出。隨后選用合適的洗脫液，改變結合條件，將具有親和力的蛋白質洗脫下來進行鑒定。

比如：劉傳緒等[4]將腺花香茶菜中的活性成分腺花素作為分子探針，垂釣出其潛在的靶蛋白過氧化還原酶Ⅰ/Ⅱ，發現腺花素通過特異性靶向過氧化還原酶Ⅰ/Ⅱ，誘導急性髓細胞性白血病細胞分化，進而起到治療作用；Dong 等[5]運用親和垂釣技術發現天然產物Ainsliadimer A 可以選擇性地與IKKα/β蛋白上保守的46 位半胱氨酸殘基結合，進而通過變構效應抑制其活性以阻斷NF-κB 信號通路，實現抗癌、抗炎作用；此外，親和垂釣技術還運用于淫羊藿苷抗神經細胞凋亡的靶點研究、遠志酯抗炎癥作用的靶點探索等[6]。

本課題組以人參皂苷作為配體，與固相載體偶聯制備親和樹脂，利用親和垂釣技術鑒定出肌肉型肌酸激酶（CK-MM）可能是人參皂苷在骨骼肌中的潛在作用靶點之一。隨后課題組以20(S)-原人參二醇（PPD）為代表通過生物膜層干涉技術、等溫滴定量熱法、分子對接等多種方法，驗證了20(S)-PPD 與CK-MM 的特異性結合。體內外實驗顯示，20(S)-PPD 與CK-MM 的結合能提高CK-MM 的酶活，進而改善運動性能，從而發揮抗疲勞的藥效[7]；此外，本課題組還通過親和垂釣法結合SDS-PAGE 凝膠電泳、質譜法和生物膜層干涉技術等，探究人參總皂苷在腦內的潛在作用靶點，發現14-3-3蛋白是人參總皂苷腦內的作用靶點之一，人參皂苷體內代謝產物原人參二醇、原人參三醇可能是14-3-3蛋白的激活劑[8]。

親和垂釣是最早提出、也是最經典的靶點發現方法，廣泛應用于目標蛋白的鑒定，并取得了良好的效果。然而，這種方法也有局限性：固定化可能會導致天然產物活性的改變；相互結合處的空間結構容易受到阻礙，因此難以找出與該空間結構有親和力的蛋白質。這些局限性導致利用此法鑒定小分子體內的作用靶點存在一些不確定性。

1.2 噬菌體展示技術

噬菌體展示技術最初由美國密蘇里大學的Smith等人于1985年建立，它是將外源基因片段克隆至噬菌體外殼蛋白結構基因的適當位置，以融合蛋白的形式呈現在噬菌體的表面，被展示的多肽或蛋白質可保持相對的空間結構和生物活性。該技術在抗原表位分析、分子間相互識別、新型疫苗及藥物的開發研究方面有廣泛的應用前景[9]。

近年來，噬菌體展示技術被運用于探索小分子藥物體內的作用靶點[10,11]。該技術的篩選原理又稱“生物淘洗”。與親和垂釣原理相同，該法也是利用分子與配體之間的特異性親和力進行的。首先，將待測的目標分子通過共價鍵固定化在載體上，加入噬菌體文庫，令其進行充分的相互作用并結合選擇，在此過程中，含有與目標分子特異性結合的噬菌體克隆將結合到載體上，未結合的噬菌體克隆直接被洗去。然后，使用緩沖液將已經結合的噬菌體克隆洗脫下來，用于感染宿主細胞進行擴增，獲得的噬菌體重復上述的篩選。經過3-5 輪“吸附-洗脫-擴增”的循環式篩選，最終得到的噬菌體克隆經初步結合試驗鑒定后，分別選取單個克隆進行基因序列分析，根據測序結果可得到其對應的氨基酸序列，即為與目標分子結合的靶蛋白序列。

噬菌體展示技術為小分子化合物靶蛋白的篩選與鑒定提供了有效的技術支持，許多研究者已將其運用于中藥有效成分的研究中。Rodi等[12]運用該技術對抗癌藥物紫杉醇進行隨機篩選，結合ELISA 檢測證實了Bcl-2 蛋白是紫杉醇在體內的作用靶點；Takakusagi等[13]利用該方法對噬菌體隨機七肽庫進行篩選，得到了抗腫瘤藥物喜樹堿的靶點蛋白；潘超等[14]利用全細胞差減篩選法對噬菌體十二肽庫進行了3 輪淘選，隨后進行DNA 序列分析，在隨機挑選的32 個噬菌體克隆種，篩選到三水白虎湯作用于類風濕關節炎滑膜細胞的靶點；Wang等[15]通過噬菌體展示實驗結合CETSA和Isothermal titration calorimetry（ITC）分析，發現人參皂苷Rh2 直接與重組或細胞內膜聯蛋白A2結合，首次提出Rh2抑制癌細胞生長的細胞靶點和分子途徑。

該技術的優點包括：基因型與表現型的直接聯系，使得噬菌體文庫可以經過簡單易行的篩選后進行操作；噬菌體展示文庫可提供大量的蛋白質或多肽的結構信息，實現了高通量和高效率篩選的可能性。不足之處在于小分子化合物的功能基團與固相載體偶聯的同時，會使功能基團周邊的空間結構受到阻礙，因此與該空間結構有親和力的噬菌體克隆不會被“淘洗”出來；而且，通過噬菌體展示技術得到的只是“可能”的靶蛋白，還需要進一步的驗證。

2 基于非標記法對分子靶點的探索

2.1 DARTS方案

DARTS 方案由加利福尼亞大學的Jing Huang 教授課題組于2009年在《美國科學院院報》（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，PNAS）上首次提出[16]，2011年和2015年，該課題組對此方案進行了更詳細的闡述[17]。該技術巧妙地利用了蛋白酶保護現象，其原理為小分子配體與蛋白質結合后可增強該蛋白質的穩定性，避免其被蛋白酶降解，即靶蛋白的結構穩定性是通過其與相應配體的結合而改變的。通過聯合使用液相色譜和質譜法，檢測SDS-PAGE中的保護帶，實現靶蛋白的鑒定。

近年來，基于該技術探索天然小分子產物體內作用靶點的報道不斷涌現。比如，Derry 等[18]對葡萄籽提取 物（Grape seed extract，GSE）在 人 結 直 腸 癌（Carcinoma of colon and rectum，CRC）細胞中的潛在蛋白靶點進行了研究，結合液相色譜/質譜聯用技術MASCOT 蛋白鑒定數據庫，發現內質網應激反應蛋白可能是GSE 細胞內的作用靶點。進一步機制研究證實，GSE 確實能引起內質網應激反應，并強烈抑制PI3k-Akt-mTOR 通路對CRC 細胞的生物學效應。陳瀟飛[19]探究四逆湯治療心肌梗死的靶標蛋白，首先利用蛋白質組學技術在正常組織和心梗組織中鑒定出590 個相關蛋白，與模型組相比四逆湯給藥組有81 個蛋白出現了顯著變化；進而聯用DARTS方案與雙向熒光電泳技術篩選出11 個對四逆湯起作用的直接心肌靶標，分析結果顯示，四逆湯治療心肌梗死的作用主要是通過影響琥珀酸合成反應來實現。Dal Piza 等[20]人利用DARTS 技術發現，laurifolioside（大戟屬植物Euphorbia laurifolia分離得到的天然產物之一）在PC-3和MCF-7 細胞中的直接作用靶點是內涵素重鏈1；進一步通過分子動力學模擬與分子對接等技術，推測了laurifolioside 與內涵素的結合構象、氫鍵疏水鍵作用位點及結合能量。Yang 等[21]人聯合運用DARTS 技術和免疫沉淀液色譜/質譜分析，發現中藥材骨碎補的有效成分柚皮素及其體內代謝產物可通過與腦神經元上的腦衰蛋白反應調節蛋白-2 結合，促進神經元的生長，改善阿爾茲海默癥的癥狀。

該方法的優勢在于進行目標識別時不需要對小分子進行任何的化學修飾，從而避免了繁瑣的有機合成和因化合物空間結構改變帶來的生物活性丟失，可用于確定其直接結合的蛋白靶點。此外，由于實驗步驟中不包括洗滌，DARTS 可用于分析低親和力物質之間的相互作用[22,23]。但是，利用Western blotting 或考馬斯亮藍染色來闡明配體與靶蛋白的相互作用過程中，當樣品中目標蛋白豐度較低時，DARTS 法不易將目標蛋白可視化。

2.2 CETSA方案

CETSA方案由瑞典卡羅林斯卡學院的Dr.Martinez Molina 于2013年在Science 上首次提出。2014年，他在Nat Protoc 雜志上發表了詳細的方案。CETSA 是研究細胞和組織中配體與蛋白質結合的一種新的生物物理技術，該方案的原理為小分子配體與靶蛋白質結合后可增加該蛋白質的熱穩定性，導致該蛋白的溶解溫度右移，即利用了配體誘導的靶蛋白的熱穩定現象。將細胞或組織勻漿液與游離的小分子化合物直接孵育，然后進行熱變性，變性的蛋白質通過離心去除。基于熱穩定的原理，靶蛋白可耐受熱變性而被保留在溶液中，隨后采用western 印跡法對其進行檢測。CETSA 與定量質譜法結合使用可系統地研究藥物與細胞和組織樣本中靶蛋白的結合，有望成為驗證和優化藥物靶點參與的重要工具[24]。

利用該方法可以檢測配體與靶蛋白之間的相互作用，不需要任何額外的步驟即可利用完整細胞，是一種基于western blotting 和抗體對靶蛋白的高選擇性的方法。適用于多種類型的蛋白質，但對于更大、更復雜的可溶性蛋白和膜蛋白的用途尚待確定。不過，該技術需要高濃度的藥物，在發現新靶點的過程中明顯通量不足，常被用于靶點的驗證和確定[25]。

比如：林兵[26]對豆豉姜中的活性成分LC36抗類風濕性關節炎的靶點進行研究，首先通過大量文獻研究構建了包含與該疾病有關的9 種蛋白質的靶蛋白庫，然后將關鍵靶蛋白與活性成分進行對接分析，做靶點預測，最后通過CETSA 技術對預測的靶點進行驗證，發現MEK1 和cathepsin 是LC36 抗類風濕性關節炎的作用靶點。Vasaturo 等[27]聯合運用CETSA 技術與經典的生物化學方法，發現抗腫瘤活性藥物冬凌草甲素與核仁素蛋白有直接的相互作用，該發現是首次表明小分子物質可結合核仁素蛋白并抑制其功能。陳香云[28]運用CETSA 技術對新藤黃酸的抗骨肉瘤效應進行探究，發現新藤黃酸通過靶向抑制USP9x（泛素特異性蛋白酶）的活性加速干細胞因子的降解，從而抑制腫瘤細胞的增殖，為靶向治療骨肉瘤提供新思路。CETSA技術還廣泛運用于茯苓酸抗胃癌的靶點研究、兔耳風天然產物Ainsliadimer A 的抗腫瘤靶點研究[29，30]等。

2.3 SPROX方案

SPROX 與DARTS 相似，是一種基于配體誘導靶蛋白穩定性的靶點識別方法。不同的是，SPROX 并不檢測蛋白質的水解模式，而是測量目標蛋白的蛋氨酸氧化水平。其原理為當蛋白質庫與小分子化合物一起孵育時，在化學變性劑鹽酸胍存在下，通過控制其濃度來調節蛋氨酸的氧化速率，最后對蛋氨酸的選擇性氧化速率進行定量研究，繪制非氧化產物和氧化產物與鹽酸胍濃度的關系曲線，這兩條曲線的交點即為遷移中點（C1/2 值）。由于配體結合蛋白穩定性增加，必須在相對高濃度的變性劑作用下才能得到相同濃度的氧化產物，所以具有比對照樣品更大的轉折中點。C1/2 值向較高變性劑濃度移動即表示該蛋白的配體誘導了其穩定，即可對比小分子探針與空白對照組的C1/2值來判斷蛋白是否為特異性結合靶蛋白。

該方法無需大量純化蛋白質，并且可以進行多重分析[31]。其不足之處在于，無法檢測不含蛋氨酸的蛋白質與小分子的結合，同時，當蛋白質濃度較低時由于其氧化反應弱也不容易被檢測到。因此，與DARTS和CETSA 方法結合使用，相互補充，更有利于小分子靶點的發現。

目前利用SPROX 方法對中藥靶點的探究較少，DeArmond 等[32]利用該方法研究白藜蘆醇的蛋白質靶標，發現除了之前已知的靶點胞質脫氫酶外，還有6個潛在的新蛋白靶點，其中四個與蛋白質翻譯機制相關。考慮到該方案的錯誤發現率為2%-4%，研究者認為這6個新發現的潛在靶標仍需進一步的確認。

3 其它方法

由于藥物-靶點相互作用鑒定的實驗方法仍然是極其昂貴、耗時并具有挑戰性的，因此除上述高通量直接篩選的方法外，還出現了大量間接識別天然產物靶點的方法。例如基于基因組學的RNA 干擾技術和CRISPR/Cas9 基因編輯技術、基于生物信息學的Connectivity Map（CMAP）生物數據 庫和BATMANTCM在線分析工具等。

RNA 干擾技術利用shRNA 和siRNA 作為基因敲除工具，來驗證小分子與靶蛋白的相互作用，同時對藥物靶點的篩選也具有一定作用[33-34]。該技術與高通量方法結合極大增加了基因組學的應用范圍，成為了識別小分子靶點的有力工具。

與RNA 干擾技術相比，CRISPR/Cas9 基因編輯技術能有效克服脫靶[35]。運用此技術對補骨脂活性成分補骨脂乙素進行了研究，發現其通過抑制二氫乳清酸脫氫酶的活性，實現對急性髓性白血病的細胞凋亡及分化的調節作用[36]。

生物信息學是計算機科學與信息處理相結合的一門綜合性、創新性的學科。CMAP 是基于基因表達圖譜的生物數據庫，通過獲取、對比并分析不同樣本小分子的基因表達圖譜，廣泛應用于藥物發現與預測作用機制等方面[37-38]。2017年以CMAP 數據庫為基礎，建立了首個國內關于天然產物小分子的基因表達圖譜數據庫，可用于預測靶點及小分子藥理學活性[39]。Chao等[40]聯用該數據庫與CMAP發現丹參提取物丹參酮IIA的抗腫瘤作用靶點是PKCζ和PKCε。

BATMAN-TCM 是首個結合中藥復方成分作用靶點與網絡藥理學分析的工具，湯化琪等[41]利用其預測了玄胡索散對骨關節炎的治療作用靶點。

4 小結與展望

中藥具有復雜的化學成分，并且配伍藥物較多，經常是復方使用，藥物作用的特點是多靶點、多層次以及多環節。其有效成分的靶點鑒定是一個復雜且耗時的過程，需要多層次、多角度相互佐證。探究小分子與靶蛋白的相互作用不僅可以找到潛在的藥物作用靶標，而且能夠對藥物的機制和副作用有更深的了解。上述小分子靶點的探究方法都不能完全排除假陰性和假陽性的產生，而且在分離的過程中小分子的生物活性也會發生一定的改變，因此，闡述中藥有效成分的生物活性及相應的靶標常需多種方法聯合使用。相信隨著檢測技術的不斷進步，將有力推進天然產物的研發并有助于對復雜中藥體系的現代化闡述。