MicroRNAs 與中樞神經系統退行性疾病相關的研究進展

江張勝，田麗偉，趙晨玲，董 婷

阿爾茨海默病（Alzheimer’s Disease，AD）、帕金森病（Parkinson’s Disease，PD）、亨廷頓舞蹈病（Huntington’s Disease，HD）和肌萎縮性脊髓側索硬化癥（Amyotrophic Lateral Sclerosis，ALS）等中樞神經系統退行性疾病，被認為是危害較大的神經系統疾病，已成為世界性衛生保健難題［1-2］.上述中樞神經系統退行性疾病目前尚不能完全治愈，僅可通過藥物改善其癥狀.因此，需要深入研究AD、PD、HD、ALS 4 種疾病的發病機制，以提高其臨床診治效果.miRNAs 參與神經元的早期分化和發育且影響神經元的功能，miRNAs 的失調在中樞神經系統退行性疾病［3］的發病機制中至關重要.為了更好地理解miRNAs 在中樞神經系統退行性中作用的分子機制，本文從miRNAs、miRNAs 與中樞神經系統退行性疾病的關系進行論述，力求為臨床防治中樞神經系統退行性疾病奠定理論基礎.

1 miRNAs 概述

1.1 miRNAs 的生物合成特點

miRNA 是長度為20～24 個核糖核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA 分子，是重要生物過程中已知調控因子，在介導RNA 的剪切或翻譯抑制中發揮著重要的調控作用.miRNA 基因通常被RNA 聚合酶II 轉錄為原始RNA，通過核糖核酸外切酶III 剪切成發簪狀的前體miRNA（pre-miRNA），然后通過輸出蛋白Ⅴ［4］輸出到細胞質中.在細胞質中，pre-miRNA 被核糖核酸內切酶切割成miRNA 雙鏈，其中一條鏈被載入RNA 誘導沉默復合體（RISC）中的Argonaute（AGO）蛋白中，并作為與蛋白編碼RNA（mRNA）結合的引導序列與靶基因mRNA 的3’非翻譯區（3’UTR）堿基的互補配對發揮其沉默靶基因的表達作用［5］.

研究表明，超過60%的人類基因是由miRNAs調控的，miRNAs 被證明大多數存在于腦組織、腦脊液和血清中.從腦組織活檢中收集到miRNAs 的表達可以反映腦細胞外間隙液的組成，并作為疾病的非侵入性生物標記物［6］.

1.2 miRNAs 的作用機制

研究表明，miRNAs 的典型作用機制是基于序列互補性與3’UTR 的相互作用.最近的研究表明，miRNAs 的作用機制多種多樣，包括與5’非編碼區相結合對功能產生影響［7］.其具體的作用機制是miRNAs 與其靶基因之間的相互作用通過影響mRNAs 的穩定性或影響蛋白質翻譯而改變蛋白質輸出.重要的是，miRNAs 與其靶mRNAs 之間的絕對序列互補不是必要的；這種靈活性意味著每個miRNA都可以結合和調控大量的mRNAs.因此，轉錄抑制會對靶基因進行調節，通常是同一個靶基因會結合多個miRNAs 協同作用.這些調控主要依賴于miRNAs 的核心機制和信號轉導之間的相互作用，以應對外部或內部刺激，并動態塑造miRNAs 的產生程度，以維持特定的生理或者病理生理條件下穩健的基因表達.

1.3 miRNAs 的特點和檢測

miRNAs 是穩定的，能夠抵抗內源性RNAs活性的降解.它們能夠承受惡劣的環境條件，如極端pH 值水平、長期儲存和多種不同類型體液中的多次凍融循環［8］.此外，可以使用不同的生物學技術，如二代測序（NGS）、定量實時聚合酶鏈反應（qRT-PCR）和微陣列分析等，對miRNAs 進行定量檢測.目前應用最廣泛的方法是qRT-PCR，因為它操作簡單、靈敏度高，能夠檢測較低水平的miRNAs，但只能應用于有限數量的miRNAs.NGS 允許對整體miRNAs 的表達水平進行定量分析，包括低豐度的miRNAs.此外，它還可以用來檢測新的miRNAs，但NGS 明顯比其他方法昂貴許多.因此，它可能被用來探索疾病特異性miRNAs 指紋圖譜，但目前還不適合用于臨床診斷［9］.微陣列分析能夠檢測約2 000 種選定的miRNAs，分析需要更大數量的RNA，且重現性較低，存在交叉雜交的問題［10］.對于所有的方法，人們希望從樣本中提取出所有miRNAs，是具有挑戰性的.因為與蛋白質等相比，體液中的miRNAs 濃度相對較低，再加上目前缺乏常規化、標準化的方法，導致miRNAs 仍處于初期階段，無法成為廣泛使用的生物標志物.

2 miRNAs 作為中樞神經系統疾病的潛在生物標志物

miRNAs 有可能被用于中樞神經系統的早期準確診斷，這有利于患者獲得更早和更個性化的靶向治療.盡管miRNAs 作為疾病新的生物標志物潛在價值的研究數量顯著上升，但是關于miRNAs 與中樞神經系統疾病之間關系的認識仍然存在著很大的差距.中樞神經系統的生物標志物的發現由于涉及腦的作用機制、腦組織的難以獲取、復雜的神經解剖和大腦的功能而滯后.此外，還跟環境與基因的相互作用、中樞神經系統的特異性、人群樣本分層等不同的作用因素有關.本文主要綜述4 種中樞神經系統退行性疾病，即AD、PD、HD、ALS，這些疾病均與認知障礙有關.研究了不同疾病內部和不同疾病之間miRNAs 失調的異同，對miRNAs 作為腦病理中樞神經系統疾病生物標志物的潛在價值進行綜合評估.

3 中樞神經系統退行性疾病特異性生物標志物

3.1 miRNAs 與AD

AD 是一種不可逆的、進行性的大腦紊亂、伴隨記憶和思維能力減退的中樞神經系統退行性疾病.AD 早期的主要病理特征是患者腦脊液中β 淀粉樣蛋白水平的下降、磷酸化tau 蛋白以及總tau 蛋白水平升高［11］，AD 的發病還與凋亡、炎癥、細胞周期異常等多種因素 密 切 相 關［12］.miRNAs 參 與 并 調 控AD 的 病理過程，如對CREB/LAK2/STAT3 信號通路的調控作用，參與tau 蛋白磷酸化和神經細胞凋亡等過程，β 淀粉樣蛋白代謝和炎癥、凋亡等基因都很有可能作為miRNAs 作用的靶點.

大量的人和動物實驗研究表明，異常的大腦miRNAs 靶向mRNAs 表達可能參與了AD的發 生［13-14］.在海 馬體 中，KOCERHA［15］等發現miR-9、miR-125 和miR-128 被持續地改變.在AD 的早期階段，miR-9 的變化在大腦皮層和海馬區明顯，這與β 淀粉樣斑塊形成和神經退行性變相對應.然而，小腦在疾病的后期會表現出淀粉樣蛋白積累和神經元萎縮的現象.miR-29 家族的缺失可能會導致淀粉樣蛋白裂解酶1 蛋白（BACE1）/β 淀粉樣蛋白酶水平的增加，導致散發性AD 的發生.同樣，大腦中miR-107 的下調，上調BACE1 mRNAs 水平與AD 的發生有關［16］.

KEMPF 等［17］報 道，miR-132 的 變 化 主 要發生在顯示tau 過磷酸化的神經元中，而miR-212 主要在非神經元細胞中表達.在大腦的許多區域，包括海馬體、前額葉和顳葉皮層、顳葉和額葉內側回以及小腦，它們都被下調.胼胝體也是與記憶形成相關的大腦區域.MARTIN 等［18］強調，胼胝體中miR-146 的增加不僅與AD 有關，還與癲癇和多發性硬化有關.顳區miR-501-3p 的上調腦皮質可導致AD［14］患者死后腦血管損傷和血腦屏障破壞.血液miRNA 變化是AD 理想的診斷生物標志物［19-20］.在一項大型研究中，GUO 等［21］報道了血清中的miRNAs（miR-26a-5p、miR-181c-3p、miR-126-5p、miR-22-3p、miR-148b-5p、miR-106b-3p）標志物作為AD 早期診斷的無創生物標志物.MüLLER 等［22］發現，在腦脊液中，miR-29a 作為生物標志物診斷AD 的敏感性為89%，特異性為70%.miR-139 通過調控大麻素受體2（CB2）介導的神經炎性過程參與AD 的發病，miR-139 通過下調CB2 的表達促進神經炎性反應.

綜上所述，深入研究miRNAs 在AD 發病機制中的作用有利于為AD 的診斷提供新的生物標志物，為臨床靶向治療AD 提供更大的幫助.

3.2 miRNAs 與PD

PD 是老年人最常見的中樞神經系統退行性疾病，涉及大腦多巴胺能神經元進行性丟失，表現為運動功能障礙和靜息性震顫、運動遲緩、僵直、姿勢不穩、認知障礙等臨床癥狀［23］.目前，PD 的臨床治療主要以癥狀性治療為主，包括兒茶酚-O-甲基轉移酶（COMT）抑制劑、單胺氧化酶B 抑制劑等藥物治療，以及深部腦刺激等非藥物干預［24］.雖然這些治療可以緩解帕金森病的運動癥狀，但它們在本質上并不能起到神經保護作用，也不能阻止疾病進展或逆轉神經退行性變.因此，許多人致力于了解PD 的發病機制，以發展神經保護治療.

最近，miRNAs 被發現受到PD 風險基因的調控，并很有可能通過對線粒體和免疫途徑直接調控PD 的發生.研究表明，miR-29 可調節PD 發展的各種重要過程，如細胞凋亡和神經元存活、細胞衰老、運動功能調節、免疫調節［25-26］.此外，ROSHAN 等證明，在小鼠大腦中抑制miR-29 會導致大量細胞死亡，尤其是海馬和小腦細胞死亡，這些小鼠還表現出共濟失調的特征，如步長縮短，這表明miR-29 在運動協調中的作用［27］.miR-29b 通過靶向促凋亡bh3 家族的基因來抑制細胞凋亡，從而促進神經元存活.CHOI 等［28］發現miR-7 在PD 患者中的黑質多巴胺能神經元中廣泛表達，并且通過體外實驗發現miR-7 可以促進SH-SY5Y細胞的糖酵解，使其產生更多的ATP 以滿足神經元活動能量的需求，可以有效地減少多巴胺能神經元的變性壞死.LI 等［29］發現miR-221 通過靶向作用PTEN 來調節PC12 細胞活力和凋亡，從而在PD 中起保護作用.韓凱［30］發現外周血清miR-103a、miR-30b 和miR-29a相對表達量，可以用于PD 早期診斷的無創新型標志物.ZHANG 等［31］利用逆轉錄定量PCR方法對46 例散發性帕金森病和49 例正常對照組血漿中miRNAs 的水平進行檢測，結果發現PD 患者的循環miR133b 和miR-433 表達水平較正常對照組明顯降低，miR133b 和miR-433 在對照組和PD 組中均呈現很強的相關性.表明miR133b 和miR-433 可能作為PD 的潛在生物標志物.

綜上所述，深入研究miRNAs 在PD 中的表達異常有利于為PD 的診斷提供新型生物標志物，為臨床進一步對PD 的早期診斷和治療提供新的思路和手段.

3.3 miRNAs 與HD

HD 是一種常染色體顯性遺傳性神經退行性疾病，其特征是進行性運動、行為和認知能力下降.HD 患者的病變是由染色體4 號上杭丁頓基因（HTT）的三核苷酸重復擴增，該基因產物HTT 蛋白在人類神經元中廣泛表達，具有多種功能.在一般人群中，HTT 基因中 平 均 有17～20 個CAG 重 復.CAG 重 復40 次以上，HD 的外顯率為100%，臨床表現的癥狀越重.miRNAs 是一種功能性小的非編碼RNA，也受到突變HTT 蛋白的影響.

研究發現，miR-128a、miR-34a 在HD 模型小鼠中表達降低.miR-128a 調控包括HTT 和Huntington 相互作用蛋白Ⅰ在內的HD 典型信號 基 因.KOCERHA 等［15］研究 表明，miR-128a腦中的表達水平在HD 病人的臨床表現出現前后均有下調的趨勢，提示miR-128a 參與HD的 發 病過程.HOSS 等［32］鑒 定 了HD 患者 的 腦中有75 個miRNAs 差異表達，存在5 個miRNAs（miR-10b-5p、 miR-196a-5p、 miR-196b-5p、miR-10b-3p 和miR-106a-5p）被確認與CAG 長度調整發病年齡有顯著關系，其中包括HD 病例中最強烈過表達的miR-10b-5p.盡管在這些研究中，前額皮質是組織輪廓的來源，但miR-10b-5p 表達與紋狀體參與疾病的關系獨立于皮質參與.miR-124-3p 主要在中樞神經系統中表達，在HD 的動物模型中，過表達可以導致癥狀恢復［33］.功能上，miR-124-3p 參與了凋亡信號、自噬、神經發生、谷氨酸信號和免疫調節.在這些動物模型中過表達miR-124-3p 似乎可以調節這些功能，從而限制或預防疾病的發生.

綜上所述，深入研究miRNAs 表達的差異性有利于了解miRNAs 參與HD 相關靶基因的調控，為臨床靶向治療HD 提供了一個新的手段.

3.4 miRNAs 與ALS

ALS 是一種以運動皮層、腦干和脊髓的選擇性運動神經元變性為特征導致全身進行性肌無力和肌萎縮，最終會導致呼吸麻痹致死［34］的中樞神經系統退行性疾病.目前，關于ALS 具體的發病機制并不是十分明確.可能與Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD1）基因突變、免疫炎性反應、星形膠質細胞功能異常有一定的相關性.miRNAs 能結合互補的靶序列并調節基因表達，它們是建立神經表型和中樞神經系統退行性變的關鍵分子.因此，特異性的生物標志物可以幫助疾病早期發現和診斷，也可以作為疾病進展和治療效果的指標.

MARCUZZO 等［35］研究發現ALS 轉基因鼠模型在晚期階段全腦中miR-9、miR-124a、miR-19a/19b 的表達較正常同齡對照組明顯升高.這些miRNAs 隨后在18 周的ALS 小鼠與同年齡對照組的人工解剖的腦室下區、海馬體、初級運動皮層和腦干運動核中進行分析.在腦室下區和海馬區，miR-124a 表達上調，miR-219 表達下調，神經干細胞和祖細胞數量也顯著增加.在ALS 轉基因鼠腦干運動核和原代運動皮層中，miR-9 和miR-124a 顯著上調，miR-125b 表達升高.KLATT 等［36］發現，在ALS小鼠模型中，各組織中凋亡介質的上調/下調與miR-29b-3p 的表達水平有關.在ALS 小鼠模型的小腦中，miR-29b-3p 的表達水平顯著增高，使促凋亡因子BMF、Bcl-2、Bax 和Bak1的表達下調，活化Caspase3 從而保護神經功能.miR-29 對正常的運動功能是必要的，miR-29a/b 喪失了會引起嚴重的運動障礙［37］.在脊髓中，miR-29b-3p 的表達量有所下降，對促凋亡因子的抑制作用明顯減弱，導致細胞凋亡，從而引起神經變性.因此miR-29b 的異常表達水平在ALS 的病因、發病機制中可能會起十分重要的作用，同時miR-29b 表達水平的特異性很有可能會成為ALS 早期的檢測標準和治療靶點.

綜上所述，miRNAs 與ALS 的發病機制密切相關，因此深入研究ALS 的發病機制對臨床靶向治療ALS 有十分重要的意義.

4 miRNAs 參與多種中樞神經系統疾病

大量的研究已經表明miR-29 家族和miR-132-3p 在2 種或2 種以上中樞神經系統退行性疾病中存在著異常的調控作用，這些miRNAs 似乎在導致認知缺陷的途徑中發揮了核心作用.下面對相關miRNAs作一簡要闡述.

4.1 miR-29 家族

miR-29 家族似乎在AD、PD、HD 等中樞神經系統退行性疾病中發揮著主導的作用，該家族的調控基因包括的miRNAs 分別是miR-29b-1、miR-29b-2 和miR-29c，分別是從人類基因組的1 號染色體和7 號染色體轉錄而來的［38］.miR-29b-1 和miR-29b-2 具 有相 同的 成熟序列，而miR-29a 和miR-29c 只存在一個核苷酸差異.研究表明，miR-29 家族與神經元的存活、成熟增殖、可塑性、樹突狀棘和突觸形態相關［38］.

BAI［38］等 表明，PD 患 者的血 清中miR-29家族均呈現下降的趨勢.但有趣的是，與miR-29b 相 比，PD 患 者 中miR-29a 和miR-29c的下降水平較大.因此有人指出在人類基因組中，miR-29b 的復制可能與其家族的其他miRNAs 相比有不同的方式影響其表達.血清中的miR-29a 和miR-29c 的表達水平與PD 的患病的嚴重程度呈負相關，但與疾病的患病持續時間無關.同時，女性血清miR-29a 和miR-29c 表達水平程度明顯高于男性對照組和PD 患者.眾所周知，PD 患者的男性患病率明顯高于女性.經過性別分層分析后發現，miR-29 的 差 異 主 要 是 在 男 性PD 患 者 中［39］，共同表明PD 中的miR-29 家族呈現特異性的表達水平.因此，有必要進一步研究miR-29家族在PD 患者的生理病理和發病中的作用，發現PD 患者的發病機制與miR-29 家族特異性調控之間存在的關聯性.雖然BAI 提出血清中miR-29 家族表達水平的失調是PD 患者的特異性表現形式，但也有許多的研究表明AD 患者中miR-29c 表達水平會出現失調，miR-29a 和miR-29b 與BACE1 有一定的關聯性，促 進AD 病 理 的 生 成［40］.且miR-29a 和miR-29b 水平的降低與腦的絲氨酸棕櫚酰轉移酶和β 淀粉樣蛋白水平升高相關，這表明絲氨酸棕櫚酰轉移酶和miR-29 調控因子通過神經酰胺的產生在AD 患者中發揮重要的作用［41］.

4.2 miR-132-3p

AD、PD、HD 和ALS 中神經元的可塑性及相關 通路被證明調節異常［42］.miR-132-3p 靶向參與神經元可塑性的重要通路，如DNA 甲基化和神經元cAMP 反應元件結合蛋白（CREB）、N-甲基-D-天冬氨酸受體和BDNF信號［42］.后者似乎在中樞神經系統退行性疾病的病理生理中起著主要作用，并參與神經發育和突觸的調節.miR-132-3p 通過調控BDNF 信號通路在中樞神經系統疾病的病理生理中發揮核心作用，導致常見的通路失調，最終導致認知障礙，這是中樞神經系統退行性疾病之間的共同特征［43］.因此miR-132-3p可能是中樞神經系統疾病治療和預后的潛在指標.

5 結語

近年來，隨著生物學研究方法和技術的不斷更新，miRNAs 的功能也被不斷地揭示出來.大量研究表明，miRNAs 轉錄后調控靶基因蛋白質的表達與中樞神經系統疾病的發病機制和病理生理有著密切的相關性.在中樞神經系統中miRNAs 調控著神經細胞增殖、分化、凋亡的過程；在病理過程中miRNAs 亦在疾病的發生發展、損傷后修復等方面發揮著重要的調節作用.進一步闡述miRNAs 在中樞神經系統中如何調控靶基因的表達并成為疾病的相關靶點，可以為研究中樞神經系統退行性疾病的發病機制提供新的分子基礎.

盡管miRNAs 成為早期臨床診斷中樞神經系統疾病的潛在生物標志物是十分有前景的，但仍存在挑戰性.如存在種族、年齡、飲食和性別等影響miRNAs 表達的相關因素.因此，我們需要更大的樣本量和專門的研究來驗證miRNAs 在中樞神經系統疾病中的有效性.此外，一種miRNAs 在大腦的不同部位、不同階段發揮作用機制也大不相同，如何精準地通過靶向藥物通過血腦屏障將miRNAs 遞送到病變部位仍需解決.因此，在miRNAs 成為臨床診治中樞神經系統疾病生物標志物之前，技術和方法的改進是十分必要的.