堆型艾美耳球蟲外分泌蛋白致細胞損傷研究

王黎霞，黃 芳，張建軍，安 健*

(1.北京農業職業學院牧醫系；北京 102442；2.北京農學院動物科學技術學院，北京 102206)

原蟲的分泌蛋白是蟲體在黏附、入侵宿主細胞及在帶蟲空泡內分泌的，惡性瘧原蟲的分泌蛋白與整蟲的免疫原性存在差異[1]。弓形蟲速殖子微線和棒狀體從頂端分泌蛋白，而致密顆粒從蟲體頂端、側面及后面分泌蛋白[2]。弓形蟲頂端識別宿主細胞后，啟動信號，使蟲體內的鈣離子水平升高，刺激微線分泌相關蛋白[3]，使蟲體黏附、入侵宿主細胞[4]，隨之棒狀體和致密顆粒分泌蛋白形成帶蟲空泡，構成空泡內微絨毛網狀結構成分[5]，促進弓形蟲的發育和分化[6]；外分泌蛋白免疫，增強IL-12、IL-10表達，使小鼠腹腔巨噬細胞的活性降低，影響弓形蟲的入侵和發育[7]，保護宿主細胞[8]，提高小鼠的保護力[9]；外分泌蛋白也是鑒定感染的重要依據[10-11]。球蟲感染后，雞腸壁彈性喪失，黏膜脫落，黏膜層變薄，內容物中40%～60%的水不被吸收，盡管雞大量飲水但仍然出現脫水癥狀，飼料利用率低，糞便變稀不成形，帶有大量黏液，雞糞便帶血，甚至出現死亡，證明雞球蟲入侵引起腸道上皮組織功能和器質上的損傷[12]，受細菌、病毒毒素致病性啟發，筆者推測球蟲的外分泌蛋白的釋放對雞體也會產生損傷，而在艾美耳球蟲的研究中未見雞球蟲外分泌蛋白致病性的報道[13]，該試驗通過牛腎傳代細胞培養E.acervulina，SDS-PAGE和Western Blot鑒定雞球蟲外分泌蛋白，吖啶橙(OA)和碘化丙啶(PI)染色判定該蛋白對細胞的損傷性，初步研究外分泌蛋白的外毒素功能。

1 材料和方法

1.1 材 料

E.acervulina、牛腎傳代細胞，北京農學院獸醫病理學實驗室保存；高糖DMEM、犢牛血清，Gibico公司產品；青霉素、胰酶，Orien公司產品；硫酸鏈霉素，Topbio公司產品。

1.2 方 法

1.2.1 雞抗E.acervulina血清制備 純化球蟲的子孢子[14]，制備可溶性蛋白加等體積的弗氏完全佐劑，每只200 μL免疫12日齡無球蟲感染的雞，10 d后二免，二免后10 d，心臟采血，分離抗E.acervulina血清[15]。

1.2.2E.acervulina外分泌蛋白分離 子孢子與細胞共培養2.5 h，使子孢子侵入細胞[16]，換入無血清培養液，每隔12 h收集該時間點前12 h的培養液，并換新培養液，至60 h。離心收集培養液上清[17]，透析濃縮，SDS-PAGE、銀染確定外分泌蛋白的大小及分泌時間，抗球蟲血清為一抗，HRP-兔抗雞抗體為二抗，Western Blot確定外分泌蛋白的來源。

1.2.3E.acervulina外分泌蛋白的細胞損傷 牛腎傳代細胞接種到6孔板，每孔100萬細胞，培養2 h，換入新培養液對照組，保持培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組，加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組，繼續培養3.5 h，吖啶橙和碘化丙啶染色鑒定細胞膜和核膜的損傷。

2 結 果

2.1 不同培養時間的E. acervulina外分泌蛋白SDS-PAGE分析

12～24 h蛋白的條帶最清晰，24～36 h蛋白條帶變暗，36～48 h幾乎看不到蛋白帶，0～12 h和48～60 h看不到外分泌蛋白，表明隨著子孢子的發育，E.acervulina外分泌蛋白的量不斷減少，見圖1。

2.2 E. acervulina外分泌蛋白的Western Blot鑒定

Western Blot檢測發現1條清晰的70 kD反應條帶與抗E.acervulina血清反應(圖2)，說明該蛋白是E.acervulina分泌的。

2.3 E. acervulina外分泌蛋白對牛腎傳代細胞的損傷

新培養液對照組、培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組和加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組在自然光和吖啶橙染色綠色熒光下未發現差異(圖3A、3D、3G和圖3B、3E、3H)，說明細胞的遺傳物質沒有受到損傷；在碘化丙啶染色紅色熒光下，新培養液對照組與培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組比較沒有區別，說明培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組對細胞膜和核膜沒有損傷(圖3C、3F)，加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組與新培養液對照組和培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組三者比較，加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組的細胞，在細胞形態上未見改變，碘化丙啶染色紅色熒光細胞明顯增多(圖3C、3F、3I)，說明加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組細胞膜和核膜有損傷。

3 討 論

為了分離E.acervulina的外分泌蛋白，該試驗利用無血清培養，避免培養液中血清蛋白對于試驗結果的干擾。每間隔12 h收集該時間點前12 h的培養液，濃縮后SDS-PAGE檢測發現，培養60 h內12～24 h的E.acervulina外分泌蛋白最多，Western Blot鑒定該蛋白約70 kD，該外分泌蛋白是子孢子發育成為第一代裂殖子過程中向細胞外分泌的。

巨噬細胞游走抑制因子和天冬氨酰轉移酶是E.acervulina外分泌蛋白，前者裂殖子期分泌[18]，后者在子孢子的折光體中[19]，與柔嫩艾美耳球蟲有97.4%相似度[20]，入侵時分泌。弓形蟲在入侵時分泌很多蛋白，如MIC系列、溶菌酶、醛縮酶、透明質酸酶等[21]，形成帶蟲空泡[22]，滋養體分泌穿透-增強因子，促進蟲體入侵[23]。柔嫩艾美耳球蟲子孢子分泌EtSAG10、EtMIC5和TA4[24]。該試驗分離得到的外分泌蛋白約70 kD，與已知蛋白大小有明顯差異，推測為一種未知蛋白。

弓形蟲外分泌蛋白可提高弓形蟲的穿透能力和繁殖能力[13]，說明外分泌蛋白對寄生細胞和非寄生細胞都有作用，作為信號而影響其他細胞。球蟲寄生的細胞核增大或者減小，細胞質空泡化或呈現不規則，裂殖體成熟，裂殖子溢出細胞時，空泡化不僅在寄生細胞，臨近無寄生細胞也發生[25]，預示球蟲外分泌蛋白的毒素作用。

吖啶橙能透過完整細胞膜，用于鑒定雙鏈DNA損傷，與雙鏈DNA結合發綠色熒光，與單鏈核酸結合發紅色熒光。碘化丙啶不能透過正常細胞膜和核膜，用于鑒定膜損傷，它與核酸結合發出紅色熒光[26]。該試驗中，新培養液對照組、培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組和加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組在自然光和吖啶橙染色綠色熒光下無差異，說明細胞核酸沒有受損；在碘化丙啶染色紅色熒光下，新培養液對照組與培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組比較無差異，說明培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組細胞膜沒有受損，加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組與新培養液對照組和培養過牛腎傳代細胞的培養液對照組三者比較，加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組的細胞，在細胞形態上改變不是很大，紅色熒光細胞明顯增多，說明加球蟲外分泌蛋白的培養液試驗組膜有損傷，它引起細胞膜、核膜的通透性增加。該蛋白可能與第一代裂殖子從細胞溢出、入侵新的宿主細胞有關，同時，該外分泌蛋白具有球蟲外毒素的功能，也具備作為球蟲免疫的候選抗原的可能性，而該蛋白是否促進裂殖子溢出、入侵新的細胞、是否有免疫原性及在雞體是否具有同樣作用需進一步研究。

該試驗通過牛腎傳代細胞培養、SDS-PAGE和Western Blot發現一條70 kD的E.acervulina外分泌蛋白，在第一代裂殖體形成中分泌，它引起細胞膜和核膜的通透性增加，說明該E.acervulina外分泌蛋白具有球蟲外毒素的功能。