外泌體miR-218抑制脂多糖誘發(fā)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫因子釋放研究

謝彤彤，付博凡，姚鑫鑫，盛熙暉，郭 勇，肖龍菲，倪和民，王相國(guó)

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

奶牛子宮內(nèi)膜炎(Cow endometritis)是影響奶牛群體繁殖性能的一種主要疾病。奶牛子宮內(nèi)膜炎會(huì)造成母牛子宮的組織損傷、胚胎的死亡、早期流產(chǎn)、卵巢周期推遲、黃體期延長(zhǎng)、胎間距增大等一系列的不良后果[1-3]，同時(shí)也是引起母牛不孕和胎兒死亡的重要原因之一[4]。母牛患子宮內(nèi)膜炎后，通常會(huì)導(dǎo)致生產(chǎn)性能降低，進(jìn)而降低泌乳量和懷孕率，給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。這些問(wèn)題在奶牛養(yǎng)殖業(yè)中大量存在，并且已經(jīng)嚴(yán)重?fù)p害奶牛的繁殖性能，阻礙奶牛養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展，同時(shí)，奶牛子宮內(nèi)膜炎的中西藥治療使得養(yǎng)殖成本增加，給養(yǎng)殖戶造成額外的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。急需一種有效且廉價(jià)的方法治療奶牛子宮內(nèi)膜炎癥。

北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物育種與輔助生殖實(shí)驗(yàn)室前期已從奶牛子宮腔液中分離并鑒定外泌體內(nèi)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR218在患子宮內(nèi)膜炎奶牛子宮組織中的表達(dá)量顯著低于健康牛子宮組織的表達(dá)量[5]。該試驗(yàn)擬通過(guò)大腸桿菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞(Endometrial epithelial cells，EEC)構(gòu)建奶牛子宮內(nèi)膜炎體外模型，從培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和脂多糖刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)分離鑒定外泌體及其中miR218的表達(dá)。通過(guò)外泌體融合和mimics 218轉(zhuǎn)染檢測(cè)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體及其miRNA對(duì)減輕脂多糖誘發(fā)免疫因子釋放的作用。探究奶牛子宮內(nèi)膜炎診斷新的標(biāo)識(shí)因子，進(jìn)而為從基因水平治療奶牛子宮內(nèi)膜炎提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及其培養(yǎng)

奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞系購(gòu)自國(guó)家實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞平臺(tái)。放置在培養(yǎng)基(minimum essential medium，MEM)(含10%胎牛血清，100 μg/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素)中，在37 ℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)，每2 d更換新鮮培養(yǎng)基。

1.2 主要試劑

基礎(chǔ)培養(yǎng)液MEM(賽默飛公司)、無(wú)外泌體胎牛血清(Exosomes-depleted FBS Media Supplement，安諾論公司)、脂多糖(西格瑪公司)、牛腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(江萊生物)、牛白細(xì)胞介素-1β酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒(江萊生物)、外泌體提取試劑盒(貝博公司)和PKH26(西格瑪公司)。

1.3 檢測(cè)細(xì)胞增殖

細(xì)胞生長(zhǎng)速率達(dá)到80%后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液洗滌，依次加入0、5、10、50、100 μg/mL(n=6)脂多糖(培養(yǎng)基0%FBS配置)，24 h后向每孔加入10 μL CCK-8，在37 ℃下孵育2 h，用酶標(biāo)儀測(cè)量每個(gè)孔在450 nm的吸光度(OD)。

1.4 測(cè)定IL-1β和TNF-α

待細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)90%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，其中一板加入100 μg/mL脂多糖(此為試驗(yàn)組)，另一組繼續(xù)培養(yǎng)(此為對(duì)照組)，收集24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基，依照江萊生物牛IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)試劑盒操作，測(cè)得OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值換算成pg/mL。

1.5 外泌體形態(tài)觀察及檢測(cè)

待細(xì)胞生長(zhǎng)率達(dá)90%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，其中一板加入100 μg/mL脂多糖(此為試驗(yàn)組)，另一組繼續(xù)培養(yǎng)(此為對(duì)照組)，采集24 h后的細(xì)胞培養(yǎng)基，依照貝博公司外泌體(Exosomes，exo)提取試劑盒操作，分別獲得脂多糖處理后外泌體和正常外泌體備用。外泌體使用負(fù)染色法，并用透射電子顯微鏡形態(tài)學(xué)染色。將脂多糖處理后外泌體和正常外泌體分別提取蛋白用Western Blot檢測(cè)外泌體標(biāo)志蛋白CD63；并且分別提取mRNA，測(cè)定其OD值。

1.6 熒光定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)

將1.5中得到的mRNA進(jìn)行熒光定量PCR測(cè)定，檢測(cè)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體與脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體中miR218的表達(dá)量。

定量PCR引物，設(shè)計(jì)并合成由吉馬基因完成，持家基因GAPDH的引物由上海生物合成，使用primer5.0軟件設(shè)計(jì)，引物序列見(jiàn)表1。

表1 miR-218，GAPDH基因引物Tab.1 miR-218, GAPDH gene primers

1.7 細(xì)胞觀察

細(xì)胞生長(zhǎng)速率達(dá)到80%后，棄去培養(yǎng)基并用磷酸鹽緩沖液洗滌，加入100 μg/mL脂多糖培養(yǎng)24 h，加入熒光標(biāo)記試劑盒(Red Fluorescent Cell Linker Mini Kit，PKH26)染色的脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用DAPI進(jìn)行核染色，共聚焦顯微鏡觀察。

待細(xì)胞生長(zhǎng)速率達(dá)80%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，同時(shí)加入100 μg/mL脂多糖培養(yǎng)24 h，試驗(yàn)組加入子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體，對(duì)照組不做操作繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)基，依照江萊生物牛IL-1β、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定檢測(cè)試劑盒操作，測(cè)得OD值。并檢測(cè)miR218在細(xì)胞中的表達(dá)。

1.8 轉(zhuǎn)染細(xì)胞

待細(xì)胞生長(zhǎng)速率達(dá)80%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，轉(zhuǎn)染mimics 218和mimics NC到細(xì)胞中培養(yǎng)24 h，加入100 μg/mL脂多糖繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染mimics 218的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞。

我們應(yīng)該認(rèn)識(shí)到的是，目前肥料染色問(wèn)題已經(jīng)從行業(yè)自律，上升到法律的約束。非有效染色劑的運(yùn)用，可能涉嫌違法，并需要承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任，這一定不是化肥生產(chǎn)者愿意面對(duì)的，也是我們必須要引起重視的。如果要改變這一局面，我們需要的是依靠技術(shù)的進(jìn)步。我國(guó)化肥工業(yè)界一定有能力作出改變。

待細(xì)胞生長(zhǎng)速率達(dá)80%，棄去培養(yǎng)基，磷酸鹽緩沖液清洗，同時(shí)加入100 μg/mL脂多糖培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基，依照江萊生物牛IL-1β、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒操作，測(cè)得OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，將OD值換算成pg/mL。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 20.0軟件統(tǒng)計(jì)并分析數(shù)據(jù)。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示，*代表P<0.05，表示差異顯著，**代表P<0.01，表示差異極顯著。應(yīng)用Graphpad prism7.0統(tǒng)計(jì)軟件生成柱狀圖。

2 結(jié) 果

2.1 脂多糖對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖的影響

脂多糖0、5、10、50和100 μg/mL，處理24 h，對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖影響顯著，見(jiàn)圖1。脂多糖100 μg/mL，處理24 h，對(duì)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞增殖呈現(xiàn)顯著抑制(P<0.05)。

2.2 脂多糖對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞IL-1β和TNF-α釋放的影響

使用100 μg/mL脂多糖處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞24 h，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1β、TNF-α含量均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，見(jiàn)圖2。說(shuō)明脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞誘發(fā)炎癥因子的釋放。

2.3 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體分離與鑒定

采用透射電鏡對(duì)兩組提取的外泌體(子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體和脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體)形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)，見(jiàn)圖3。提取的外泌體大小均一，直徑均在30～150 nm之間，外形呈圓形或橢圓形的茶托樣結(jié)構(gòu)，可見(jiàn)明顯的膜性結(jié)構(gòu)，形態(tài)無(wú)較大差異(圖3A，箭頭所指為外泌體)，且均表達(dá)外泌體標(biāo)識(shí)蛋白CD63(圖3B)，子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體和脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體的mRNA的OD值無(wú)明顯差異(圖3C)。說(shuō)明從培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和脂多糖刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)能夠分離出外泌體，并且外泌體內(nèi)RNA成分含量無(wú)差異。

2.4 脂多糖對(duì)外泌體中miR218表達(dá)影響

脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體中miR218的表達(dá)量顯著低于正常培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體中miR218的表達(dá)量(P<0.01)，見(jiàn)圖4。說(shuō)明分離的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體與脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體內(nèi)miR218表達(dá)出現(xiàn)顯著差異。

2.5 正常培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體對(duì)脂多糖誘發(fā)免疫因子釋放的影響

正常培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體(PKH26著色)能夠與脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞融合，并與調(diào)節(jié)炎性因子釋放相關(guān)的NF-Κb(p65)蛋白共定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖5A)。與此同時(shí)，正常培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體顯著抑制100 μg/mL脂多糖處理誘發(fā)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中的IL-1β和TNF-α釋放(P<0.05)，見(jiàn)圖5B。此外，正常培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體隨著與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的融合顯著增加脂多糖處理子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)miR218的含量(P<0.05)，見(jiàn)圖5C。

2.6 MiR218對(duì)脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中IL-1β和TNF-α釋放的影響

Mimics 218進(jìn)入到被轉(zhuǎn)染的脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中，主要與磷酸化的p65(p-p65)蛋白細(xì)胞核外部分共定位(圖6A)。與此同時(shí)，轉(zhuǎn)染mimics 218顯著抑制脂多糖刺激子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中TNF-α的釋放(P<0.05)，而對(duì)IL-1β釋放無(wú)明顯影響(圖6B)。

3 討 論

3.1 脂多糖對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞影響

大腸桿菌所產(chǎn)生的脂多糖是引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的重要因素，所以脂多糖是與子宮內(nèi)膜炎相關(guān)的典型的病原分子形式[6]。有關(guān)病原學(xué)研究表明，革蘭氏陰性菌感染雌性生殖道是引起不孕、早期流產(chǎn)及子宮感染的重要病原之一[7]。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，使用革蘭氏陰性菌來(lái)源的內(nèi)毒素-脂多糖作為病原相關(guān)分子模式可以很好模擬細(xì)菌感染而引發(fā)炎癥反應(yīng)。將脂多糖作為病原相關(guān)分子形式模擬細(xì)菌感染、制作體內(nèi)和體外炎癥模型，已經(jīng)成為子宮內(nèi)膜炎相關(guān)研究中普遍利用的技術(shù)方法。大腸桿菌利用特殊的毒力因子脂多糖導(dǎo)致組織損傷并促進(jìn)疾病，從而導(dǎo)致宿主對(duì)內(nèi)源性免疫系統(tǒng)指導(dǎo)的細(xì)菌反應(yīng)[8]。大量研究證明，動(dòng)物機(jī)體以及多種細(xì)胞在體外可以被脂多糖誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)[9]。研究報(bào)道，在未患有疾病的奶牛子宮內(nèi)膜中，IL-1α、IL-6、TNF-α的mRNA水平顯著低于臨床型子宮內(nèi)膜炎的奶牛，隱性奶牛子宮中IL-1α、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)與臨床型無(wú)明顯區(qū)別[10]。該試驗(yàn)中，脂多糖為100 μg/mL，作用24 h時(shí)，可誘導(dǎo)奶牛子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的免疫應(yīng)答，并且在細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-1α、TNF-α分泌均有大幅提高。

3.2 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體提取可用于后續(xù)研究

外泌體是通過(guò)身體的大部分細(xì)胞分泌的30～150 nm的直膜囊泡。外泌體擁有脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)層，它主要由蛋白，脂質(zhì)，核酸構(gòu)成[11]。外泌體可以攜帶DNA，編碼RNA和非編碼RNA和蛋白。外泌體可以作為疾病的生物標(biāo)志物。一直以來(lái)人們認(rèn)為，細(xì)胞之間的交流都是通過(guò)細(xì)胞間接觸或者分子實(shí)現(xiàn)，如激素，如神經(jīng)遞質(zhì)等。自從外泌體被發(fā)現(xiàn)以來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)它是細(xì)胞間信息傳遞的方式之一，它作為細(xì)胞間交流的媒介，參與細(xì)胞間物質(zhì)傳遞與信息傳遞。外泌體可以直接或者間接與靶細(xì)胞接觸，進(jìn)行信號(hào)傳遞。Rao等[12]和Khan等[13]研究表明，外泌體在腫瘤診斷、細(xì)胞遷移生長(zhǎng)、組織修復(fù)、和其他抗原呈遞外來(lái)體的免疫中起著非常重要的作用。該研究中采用的外泌體提取試劑盒分離獲得外泌體，操作簡(jiǎn)單，純度高，經(jīng)過(guò)透射電子顯微鏡和Western Blot兩種方法對(duì)外泌體的結(jié)構(gòu)大小進(jìn)行驗(yàn)證和表面蛋白驗(yàn)證。外泌體提取試劑盒獲得的外泌體能夠應(yīng)用于后續(xù)試驗(yàn)。

3.3 MiR218調(diào)節(jié)脂多糖刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫因子釋放

miRNA是一類非編碼RNA分子，長(zhǎng)度為22～25個(gè)核苷酸。它們通過(guò)抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)mRNA的降解而起作用。越來(lái)越多的證據(jù)顯示miRNA具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)細(xì)胞活力、細(xì)胞死亡和細(xì)胞遷移[14-15]。Asangani等[16]、Prasad等[17]和Tavazoie[18]目前研究證明，miR218可能參與調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，例如口腔癌，急性淋巴細(xì)胞白血病，肺癌，結(jié)腸癌，胃癌和宮頸癌。外泌體中的miRNA在疾病中發(fā)生和發(fā)展情況之間的聯(lián)系越來(lái)越受到研究者的關(guān)注[19-20]。外泌體作為miRNA表達(dá)時(shí)的載體是最近研究的方向之一[21]。在腫瘤領(lǐng)域中，miR218已被證明可通過(guò)靶向Bmi-1或ROBO等蛋白的表達(dá)抑制各種腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲[22]。該研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR218的模擬物顯著抑制脂多糖刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α的釋放，對(duì)IL-1β的釋放沒(méi)有影響。然而，正常培養(yǎng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞來(lái)源外泌體能夠同時(shí)抑制脂多糖刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的釋放。說(shuō)明外泌體內(nèi)不同成分共同調(diào)節(jié)脂多糖誘發(fā)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫因子的釋放。MiR218僅僅可以作為其中的一個(gè)調(diào)控因子，調(diào)節(jié)脂多糖刺激的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫因子的釋放。

4 結(jié) 論

正常情況下，miR-218能夠隨著健康子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞分泌外泌體進(jìn)入到鄰近細(xì)胞或其自身內(nèi)，并與磷酸化p65核外部分共定位并抑制自身免疫因子的釋放。當(dāng)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞受到脂多糖刺激后，包裹進(jìn)外泌體內(nèi)miR218減少，從而解除其對(duì)周?chē)訉m內(nèi)膜上皮細(xì)胞免疫因子的抑制，進(jìn)而加重免疫反應(yīng)。