大豆黑斑病病原菌鑒定

王 佳，任俊達，李瑋瑜，尚巧霞*

(1.北京農學院生物與資源環境學院/農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206；2.北京農學院植物科學技術學院/農業應用新技術北京市重點實驗室/植物生產國家級實驗教學示范中心，北京 102206)

大豆(Glycinemax (Linn.))原產于中國，種植歷史悠久，在世界各地廣泛種植，是重要的油糧飼兼用作物[1-3]。

大豆黑斑病是鏈格孢屬真菌(Alternariasp.)引起的一種常見病害，在世界各大豆種植區普遍發生，中國吉林、黑龍江、遼寧、四川、湖北、山西、安徽、江蘇和浙江等多個省份的大豆產區均有發生報道[4-10]。該病害在田間主要危害大豆葉片、豆粒和豆莢，常在植株生長后期發生，偶有危害幼嫩植株。鏈格孢能夠產生毒素，不僅對大豆植株有致病性，影響植株的生長、降低大豆品質和產量，而且帶有毒素的大豆籽粒對人或牲畜具有誘變性、致癌性和致畸性等毒性作用，對其健康構成威脅[11-12]。

隨著種植品種、栽培方式、田間管理措施等方面的變化，個別年份有些地區的黑斑病對大豆植株的危害嚴重[13]。1994年中國黑龍江省大豆黑斑病大面積發生，發病株率100%，造成大豆減產60%以上[13]。2016年大豆黑斑病在中國遼寧省的發病率達48%[14]。

2019年8—9月，筆者在北京市順義區和山西省晉中市太古縣大豆種植田調查發現大量感染黑斑病的大豆植株，發病植株的葉片和豆莢上產生形狀不一的褐色病斑，葉片上病斑連接成片、出現穿孔，嚴重植株葉片干枯脫落、豆莢出現癟粒。田間黑斑病發病率達30%～60%，嚴重影響結莢期的大豆植株生長，目前未見北京和山西地區大豆黑斑病的病原種類的報道[15-16]。筆者對引起北京和山西部分地區大豆黑斑病的病原菌進行分離鑒定和致病性測定，對該病的研究和防治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年8—9月分別于北京市順義區和山西省晉中市太古縣大豆種植田采集具有典型黑斑病癥狀的大豆葉片、現場拍照，做好調查記錄后樣品置于4 ℃冰箱保存。

1.2 病原菌的分離培養與純化

采用組織分離法從新鮮病葉上選取具有典型癥狀的單個病斑，用解剖刀從病健交界處切取大小為5 mm×5 mm病組織。經75%乙醇處理30 s后用NaClO處理3 min，無菌水連續漂洗3次，再用滅菌濾紙吸去組織表面多余的水分，移入PDA平板中央，進行28 ℃培養[17-18]。

采用瓊膠平板表面單孢子挑取法對分離到的病原菌進行純化[17]。

1.3 病原菌的形態學鑒定

觀察并記錄病原菌菌落、分生孢子、厚垣孢子和菌絲的形態特征[18]。

1.4 病原菌的分子生物學鑒定及分子序列分析

利用植物基因組DNA快速提取試劑盒(北京博邁德基因技術有限公司)對病原菌純培養菌絲DNA進行提取，用引物ITS1/ITS4對ITS基因片段進行PCR擴增，反應條件為預變性95 ℃ 4 min；變性95 ℃ 30 s，退火56 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 45 s，共35個循環；最后72 ℃延伸7 min[18-19]。PCR擴增產物用0.1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，北京博邁德基因技術有限公司對其測序。將所得序列于NCBI進行同源性比對，并使用MEGA7.0的最大簡約法(Maximum parsimony)構建系統進化發育樹[2]。

1.5 病原菌的致病性測定

采用菌絲塊接種法對純化的病原菌進行致病性測定[20-21]。將品種為‘黑大豆’大小一致的離體大豆健康葉片放入70%酒精表面處理1 min，從純化的病原菌菌落邊緣上取直徑為5 mm的菌餅，刺傷接種到葉片上，對照為刺傷接種無菌PDA塊的葉片，28 ℃保濕培養。觀察發病癥狀，當大豆葉片發病后開始拍照并記錄，再次取發病的病組織進行分離純化，比較其是否與最初分離到的病原菌一致。

2 結果與分析

2.1 典型病害癥狀

該病害在田間普遍發生，主要危害大豆葉片，也可危害豆莢。葉片染病，初期形成褐色病斑，呈圓形至不規則形狀，且病斑周圍有明顯的黃色至橘黃色暈圈；發病后期，病斑擴大相互連接成片，甚至出現穿孔，最終葉片干枯脫落。豆莢染病，形成橢圓形至不規則形狀的黑褐色病斑，嚴重時完全變成黑褐色，出現癟粒(圖1)。

2.2 病原菌的形態學鑒定

分別從北京和山西部分地區各采集5片具有大豆黑斑病典型癥狀的病葉進行病原菌分離培養，5 d后用瓊膠平板表面單孢子挑取法進行純化，得到相同的病原菌菌株。

菌落初期為白色絨毛狀，后變橄欖綠色至墨綠色，最后為黑褐色，邊緣乳白色呈不規則形狀，且生長緩慢(圖2)。

利用光學顯微鏡觀察，菌絲有隔，且具有分枝，寬3.0～4.5 μm。分生孢子呈倒棒形或橢圓形，暗褐色，無嘴喙或甚短，(13.5～26.0) μm×(6.5～12.0) μm，有橫膈膜1～3個，縱膈膜1～2個。厚垣孢子球形或近球形，單生，橄欖色，直徑14.0～18.0 μm(圖3)。該病原菌與標準鏈格孢的形態特征描述相吻合，因此將其初步鑒定為鏈格孢(Alternariaalternata)。

2.3 病原菌的分子生物學鑒定及序列分析

進一步選取分離得到的病原菌進行分子生物學鑒定，利用引物ITS1/ITS4對其DNA進行PCR擴增，得到ITS基因片段，大小為561 bp。使用NCBI進行核苷酸序列比對分析，ITS基因序列(GenBank登錄號：MT027104.1)與A.alternata(GenBank登錄號：MN646267.1)的一致性為100%。用Maximum parsimony法以ITS基因序列構建系統發育樹表明，與A.alternata(GenBank登錄號：MN646267.1)親緣關系較近(圖4)。該次調查的北京和山西部分地區引起大豆黑斑的病原菌為鏈格孢(Alternariaalternata)。

2.4 病原菌的致病性測定

將病原菌刺傷接種到3片‘黑大豆’的葉片上，

接種3 d后，‘黑大豆’的葉片產生淺褐色圓形或不規則小斑，中間顏色略深，隨后逐漸發展成褐色病斑，并連接成片，斑點數量逐漸增加，有暈圈(圖5)。對照組的葉片沒有病斑。刺傷接種葉片均發病，且與自然發病癥狀相同，從該發病葉片上分離出的病原菌與所接種的病原菌形態特征和ITS基因序列相同。

通過對分離得到的大豆黑斑病病原菌進行形態學特征鑒定、ITS基因序列分析及致病性測定，北京和山西部分地區大豆黑斑病由鏈格孢(Alternariaalternata)引起。

3 討 論

中國大豆黑斑病的病原有A.alternata、A.tenuissima和A.brassicae，可導致大豆葉片和豆莢產生不同的癥狀[6]。筆者對北京和山西部分地區發生的大豆黑斑病的癥狀進行比較分析，并對病原菌進行分離鑒定和致病性測定，北京和山西部分地區大豆黑斑病病原菌均為A.alternata，但是否存在其他種類的鏈格孢菌侵染發病的情況，還有待于進一步調查研究。

A.alternata寄主范圍廣泛、侵染力強和傳播途徑多，可引起多種經濟作物病害，如馬鈴薯早疫病、番茄黑斑病、棉花輪紋病、煙草赤星病、梨黑斑病、棗縮果病、生菜黑斑病、甜瓜黑斑病、茶樹鏈格孢葉斑病等，影響經濟作物的品質和產量，給農業生產帶來嚴重的經濟損失[18,22-28]。開展早期的預防診斷，篩選抗性種質資源，采用多種防治措施，可降低鏈格孢對農業生產造成的危害并減少損失。