根癌農桿菌介導蘋果愈傷組織遺傳轉化體系的優化

牛淑慶，陳 麗，李雨欣，田 佶，姚允聰，張 杰

(北京農學院植物科學技術學院/農業應用新技術北京市重點實驗室/植物生產國家實驗教學示范中心，北京 102206)

蘋果(MalusdomesticaBokh.)是落葉喬木。起源于歐洲和亞洲的中部地區，已經具有悠久的栽培歷史，品種較多，分布較廣，全世界溫帶地區均有種植。通過記載可知，蘋果的栽培已有3000多年歷史。從剛開始寥寥無幾栽培品種，到現在通過長期自然選擇以及人工栽培育種下，已經有較多的蘋果品種。尤其是近代以來，人們通過雜交、嫁接、芽變等各式各樣的先進育種方法，有許多的新品種被創造出來，目前，在全世界，蘋果品種已達到1萬個左右。其中，生產上常用的栽培品種有20多個。隨著科學技術不斷進步以及生物工程快速發展，加上目前蘋果基因組測序數據，蘋果中基因的功能在研究和鑒定，通過轉基因技術將目的基因轉入到蘋果中從而進行功能基因的鑒定，已經是一種主要的方法，其中遺傳轉化體系的建立與優化則是重要的研究內容。

根癌農桿菌介導法，其易操作、低費用、高效率等優點成為轉基因策略中的首選方法[1]。利用根癌農桿菌為載體，將目的基因轉入到植物細胞的染色體中，目的基因的特性能夠進行遺傳，從而得到轉基因植株。自從James等[2]首次報道獲得綠袖蘋果遺傳轉基因植株以來，蘋果轉基因研究迅猛。在蘋果的遺傳轉化中，有眾多因素起著十分重要的作用，包括基因型、外植體、培養基、植物生長調節劑等原因。蘋果遺傳轉化的進步，對蘋果遺傳育種方面提供便利，能夠增加育種的效率，并且還為其他果樹的遺傳轉化提供參考價值[3-6]。目前雖然根癌農桿菌介導法已成為研究轉基因植物采用的主要方法[7]，但是不同植物間利用根癌農桿菌介導法獲得的轉化效率差異很大，高效根癌農桿菌轉化體系對于轉基因植物產業化和功能基因組學等研究都具有非常重要的意義[8-9]。

該試驗以‘王林’蘋果愈傷組織為轉化研究的材料，在已經建立的遺傳轉化基礎上，優化根癌農桿菌介導的‘王林’愈傷組織的遺傳轉化系統，為遺傳轉化工作及蘋果分子育種工作提供一定的理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗所用‘王林’(Malusdomesticacv.‘Orin’)愈傷組織來自北京農學院組培中心。

1.2 方 法

1.2.1 培養基 ‘王林’愈傷組織繼代培養基1 L(pH 5.8)，4.47 g MS+1 mL 6-BA(0.4 mg/L)+100 μL NAA(0.05 mg/L)+30 g蔗糖+6 g瓊脂，高壓滅菌20 min，溫度為121 ℃。

‘王林’愈傷組織培養基1 L(pH 5.8)，4.47 g MS+1 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+50 mg/L卡那霉素+250 mg/L頭孢噻肟，高壓滅菌20 min，溫度為121 ℃。

1.2.2McmiR399d的克隆和載體構建 使用NCBI找到蘋果‘王林’的McmiR399d基因序列，設計特異性引物，利用高保真酶進行PCR擴增，膠回收目的片段并連接到克隆載體，轉化DH5α，根據載體抗性將菌液涂到帶抗性的培養基上37 ℃過夜。挑取陽性克隆進行PCR驗證，PCR驗證后挑取陽性克隆進行菌液的培養，并提取質粒、雙酶切。測序結果正確后對提取的質粒和表達載體(pRI101)和沉默載體(pTCK303)進行雙酶切膠回收目的片段和載體，將目的片段與載體的大片段用T4DNA連接酶連接后轉化DH5α，將其涂到培養基上37 ℃過夜。挑取陽性克隆培養菌液并進行酶切驗證，結果正確，載體構建完畢。

1.2.3 菌液制備 將已經構建好載體的質粒轉入根癌農桿菌菌株(GV4404)中，進行培養，選取培養基上單菌落放入帶有抗性(抗性由載體決定)的700～1 000 μL的液體培養基中，放入28 ℃搖床220 r/min震蕩培養8 h，離心收集菌液，倒掉上清，加入侵染液混勻[AS(200 μmol/L)+MES(10 μmol/L)+MgCl2]，調OD600=0.8待用。

1.2.4 愈傷組織的侵染 選取已經繼代培養20 d長勢良好，鮮嫩‘王林’愈傷組織，分成小塊放入侵染液中，搖床20 min，葉片用濾紙濾干后放置到共培養的固體培養基(MS+1 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂糖，pH 5.8)，黑暗培養3 d。

1.2.5 侵染外植體的脫菌與篩選 共培養3 d，將其置于選擇性的繼代培養基(MS+1 mg/L 2,4-D+1 mg/L 6-BA+30 g/L蔗糖+8 g/L瓊脂+50 mg/L卡那霉素+250 mg/L頭孢噻肟，pH5.8)，暗培養30 d，此過程中如果根癌農桿菌生長過多，及時更換培養基。

1.2.6 RNA提取 使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取所需植物的RNA，試劑盒購于北京艾德萊生物技術有限公司，步驟見試劑盒說明書。

1.2.7 愈傷組織的qRT-PCR檢測 使用EASYspin Plus植物RNA快速提取試劑盒提取所需植物的RNA并進行反轉錄，試劑盒購于北京艾德萊生物技術有限公司，步驟見試劑盒說明書。將反轉錄所得的cDNA為模板進行qRT-PCR，進行引物設計，利用TB Green?Premix Ex TaqTM II酶，加上RNase free H2O，放置到CFX96TM Real Time System，運用兩步法進行qRT-PCR。

1.2.8 數據分析 每個試驗3個生物學重復，通過相關分析(Excel程序)檢查各參數之間的關系。運用Origin 8.0，Adobe Photoshop CS5等軟件進行數據的處理和分析。

2 結果與分析

2.1 激素對愈傷組織繼代培養的影響

激素對愈傷組織繼代培養的影響見表1。2,4-D 0.5 mg/L，6-BA 0.6 mg/L，由于沒有達到愈傷組織所需的質量濃度，愈傷組織并沒有生長。2,4-D 1.5 mg/L，6-BA 1 mg/L，因為其已經超過愈傷組織的所需質量濃度，愈傷組織開始慢慢出現黑化現象，并伴隨較多的水漬。2,4-D 1 mg/L，6-BA 0.8 mg/L，愈傷組織的分化速度和生長情況良好，2,4-D 1 mg/L，6-BA 0.8 mg/L的培養基最適合愈傷組織繼代培養。

表1 激素對愈傷組織繼代培養的影響Tab.1 The effect of hormone concentration on subculture of callus

2.2 ‘王林’愈傷組織生長時間對侵染的影響

‘王林’愈傷組織生長時間對侵染的影響如表2所示。愈傷組織10 d時，由于繼代培養的時間不充分，愈傷組織被大面積的根癌農桿菌包圍，并且水漬多。愈傷組織30 d時，由于繼代培養的時間過長，愈傷組織已經開始有慢慢衰老，且分化能力不足，加上根癌農桿菌的侵染，愈傷組織大部分死亡。愈傷組織20 d時，轉化率最高，且此時愈傷組織分化快，最適合進行遺傳轉化。

表2 愈傷組織生長時間對葉片再生的影響Tab.2 The effect of callus growth time on infection

2.3 侵染時間對愈傷組織的影響

侵染時間對愈傷組織的影響如表3所示。

在OD600=0.6的時候，根癌農桿菌侵染愈傷組織的能力比較低，對基因轉入葉片的效率降低。OD600=1.0，由于根癌農桿菌OD600值過高，脫菌的時候會出現大量根癌農桿菌，不易控制，且有污染的現象。只有OD600值為0.8，對愈傷組織的侵染最合適，因此選擇OD600=0.8。

侵染10 min，由于時間過短，并且不容易進入愈傷組織，嚴重影響遺傳轉化的效率，并且還會有假陽性的愈傷組織。而侵染30 min，由于侵染時間太長，愈傷組織受到嚴重的損傷，開始變黑和死亡，并且出現大量根癌農桿菌。愈傷組織侵染20 min，此時愈傷組織狀態最佳，因此侵染時間選擇20 min。

表3 侵染時間對愈傷組織的影響Tab.3 The effect of time and concentration of infestation on callus

2.4 卡那霉素對愈傷組織的影響

卡那霉素對愈傷組織的影響如表4所示。黑暗處理30 d，卡那霉素10 mg/L，由于卡那霉素質量濃度太低，愈傷組織并沒有太大變化，依舊生長，無法進行野生型愈傷組織和轉基因愈傷組織的選擇。卡那霉素35 mg/L，此時不管是野生型愈傷組織，還是轉基因愈傷組織都開始出現死亡現象，已經超過愈傷組織所能承受的范圍。卡那霉素30 mg/L，愈傷組織增殖迅速，適合侵染使用，并且野生型愈傷組織處于不生長狀態，不會影響轉基因愈傷組織，因此最適宜卡那霉素質量濃度為30 mg/L。

2.5 愈傷組織表達載體和沉默載體轉化根癌農桿菌及其鑒定

將帶有目的基因的根癌農桿菌進行菌液的收集，并對‘王林’愈傷組織進行侵染。根癌農桿菌OD600=0.8，選擇繼代20 d的愈傷組織分成小塊放入菌液，搖床20 min，再將其放到無抗性的固體培養基暗培養3 d，把侵染的愈傷組織轉入到帶有抗生素250 mg/L頭孢噻肟和30 mg/L卡那霉素培養基，得到轉基因愈傷組織，并對轉基因愈傷組織進行鑒定，提取RNA，通過檢測得到凝膠電泳分析結果如圖1所示。

表4 卡那霉素對愈傷組織的影響Tab.4 The effect of Kan and concentration on callus screening

在過表達McmiR399d和沉默McmiR399d愈傷組織的對照中可以明顯看出野生型并沒有條帶，而轉基因的條帶不但完整性比較好，并且條帶清晰明亮，條帶所在的位置正好是500 bp的位置。說明McmiR399d已經成功轉入到‘王林’愈傷組織中。

2.6 McmiR399d基因表達水平

檢測轉基因愈傷組織和野生型愈傷組織McmiR399d的表達量如圖2所示。通過與野生型愈傷組織相比發現，在過表達愈傷組織McmiR399d中，McmiR399d的表達量顯著增加，而沉默的McmiR399d的表達量下降；還檢測McmiR399d靶基因PHT1-4的表達量，可以看出，沉默的McmiR399d靶基因PHT1-4的表達量明顯上升，而過表達的McmiR399d靶基因PHT1-4的表達量則下降，說明基因已經轉入到愈傷組織中。

3 討 論

經過‘王林’愈傷組織遺傳轉化的試驗，提高轉化的效率，為轉基因植株的研究提供材料，建立高效的遺傳轉化體系，對轉基因技術和轉基因植物的研究都有十分重要的作用，這對研究植物提供有效的技術支撐。在‘王林’愈傷組織遺傳轉化體系的建立中，明確影響遺傳轉化的因素，并且對各個因素進行選擇，得到最適合‘王林’愈傷組織的遺傳轉化條件。

在‘王林’愈傷組織的遺傳轉化體系中發現最適合進行轉化的愈傷組織是繼代20 d的愈傷組織，生長調節劑選擇2,4-D 1 mg/L和6-BA 0.8 mg/L時，愈傷組織生長最好，并且需要找出適當的比例進行愈傷組織的繼代培養，只有植物材料在最好的狀態下才能在試驗中提供幫助。根癌農桿菌侵染時間和根癌農桿菌OD值很大程度上決定遺傳轉化的成功與否，最適合‘王林’愈傷組織進行遺傳轉化條件為根癌農桿菌在OD600=0.8時侵染20 min。

在植物轉基因過程中常添加一些酚類物質以促進T-DNA轉移，從而提高轉化效率。在共培養基中添加磷酸甜菜堿和脯氨酸等滲透保護劑可提高李和蘋果的轉化效率[10-13]。薔薇科果樹中尤其是蘋果和草莓，在基因方面的研究已經有相對穩定的遺傳轉化體系，但是這些體系依舊存在不少缺點，進一步優化遺傳轉化體系是需要深入研究的內容。隨著生物基因工程技術的發展，通過轉基因的技術，將外源基因轉入到果樹中，從而提高蘋果品質，是一種未來增加果樹種質資源的有效手段，通過根癌農桿菌介導法將構建好的帶有外源基因的過表達或者沉默轉入到植物中是獲得轉基因植株的重要方法。