牛冠狀病毒N蛋白的原核表達及核酸適配體篩選

程如楠，孔梓安，曹 莉，孫 路，岳 亮，王 真

(北京農學院動物科學技術學院，北京 102206，中國)

牛冠狀病毒(Bovine Coronavirus，BCV)是引起新生犢牛拉稀、成年牛冬痢和呼吸道疾病的重要病原之一[1]。自19世紀70年代Mebus等[2]首次在腹瀉犢牛和成年牛糞便中檢測出牛冠狀病毒之后，在多個國家相繼發現了牛冠狀病毒，目前牛冠狀病毒病廣泛流行于世界各國，對養牛業影響很大。由于牛冠狀病毒病的治療沒有特效藥，早期診斷和疫苗接種是目前較有效的預防措施[3]。目前，牛冠狀病毒的檢測方法有病毒分離鑒定、電鏡鑒別、中和試驗、酶聯免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)、RT-PCR等，而這些方法不同程度存在操作復雜、容易出現誤差、費時費力且價格昂貴等問題。而利用指數富集的配基系統進化技術(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX)獲得的適配體特異性好、成本低、易于合成和保存，且具有抗體相似的特性，能很好解決現有診斷方法的缺陷。

牛冠狀病毒基因約27～32 kb，包含2個開放閱讀框和5個結構蛋白基因，分別表達棘突蛋白(S)、核衣殼蛋白(N)、小膜蛋白(E)、包膜蛋白(M)和血凝素-酯酶蛋白(HE)5種[4]。N蛋白通過與基因組RNA、M蛋白之間相互作用，在病毒體中發揮重要的結構作用；參與基因組RNA合成的復雜機制，與病毒復制酶-轉錄酶復合物密切相關[5]。N蛋白除參與復制、轉錄、翻譯等過程外，還可增強機體細胞免疫，產生保護性反應[6-7]。由于N蛋白基因序列高度保守，N蛋白常作為該病的檢測抗原。

適配體也稱核酸適配體，是基于SELEX從人工合成的寡核苷酸文庫中篩選出與靶標高特異性、高親和力結合的DNA或RNA小片段單鏈[8]。靶分子可以是核酸、肽、蛋白、細胞等多種物質，而且適配體成本低、免疫原性低和可化學修飾的優點使其成為生物領域的研究熱點。

該研究首先原核表達出高純度高濃度的N蛋白，借助SELEX篩選獲得牛冠狀病毒N蛋白的特異性核酸適配體，為后續建立酶聯適配體方法奠定基礎，對牛冠狀病毒病的診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

牛冠狀病毒N蛋白編碼基因及擴增引物(均由北京擎科新業生物技術有限公司合成)，人工合成隨機寡核苷酸庫(84 bp)5′-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-(N)40-CTGCAGGTCGAC GCATGCGCCG-3′(N=A，T，C，G)及適配體篩選特異性引物(由北京擎科新業生物技術有限公司合成)；原核表達質粒pET-28a(+) (北京農學院動物疫病防控研究室保存)；BamHⅠ、XhoⅠ限制性內切酶(購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司)；高純質粒小量快速提取試劑盒、瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒、短片段DNA膠回收試劑盒、零背景pTOPO-TA Simple克隆試劑盒和PCR所用試劑(均購自北京艾德萊生物科技有限公司)；BL21和DH5a感受態細胞(均購自北京全式金生物技術有限公司)；His標簽可溶性蛋白純化試劑盒(購自康為世紀生物科技有限公司)；其他試劑均為分析純(購自國藥集團)；相關引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Sequences of primers

1.2 方 法

1.2.1 N蛋白重組表達載體構建 借助 Primer Premier 5.0設計N蛋白編碼基因特異性擴增引物，并將BamHⅠ、XhoⅠ 酶切位點分別插入上游引物和下游引物中。以合成的N蛋白編碼基因序列為模板，擴增目的基因(PCR體系：2×Mix 25 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，目的基因模板2 μL，ddH2O為21 μL；PCR程序：預變性95 ℃ 5 min，變性94 ℃ 40 s，退火64 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 2 min，延伸10 min，共30個循環)，并按照質粒提取試劑盒說明書從37 ℃過夜培養含pET-28a(+)的E.coli中提取pET-28a質粒。將擴增的基因產物及提取的質粒分別進行雙酶切、電泳、純化，其中酶切體系為質粒40 μL、10×Buffer 5 μL、ddH2O 1 μL、BamHⅠ 2 μL、XhoⅠ 2 μL，純化根據膠回收試劑盒說明書進行。隨后二者于22 ℃水浴鍋連接2 h。連接體系(20 μL)為目的基因12 μL、質粒5 μL、Buffer 2 μL、ddH2O 0.5 μL、T4 DNA連接酶0.5 μL。連接產物轉化BL21感受態細胞中，使用卡那抗性的LB平板培養，篩選轉化成功的陽性克隆。最后挑取陽性克隆增菌培養2 h，并將其為模板進行擴增，以鑒定目的基因是否成功導入，若出現陽性條帶則送公司測序進一步驗證。

1.2.2 N蛋白的表達和純化 取1.2.1步驟獲得的陽性菌液進行平板劃線，用卡那抗性的LB培養基，于37 ℃搖床培養單菌落至OD600=0.6。此時加IPTG誘導目的蛋白表達，誘導培養2、4、6 h的菌液用SDS-PAGE鑒定分析，并設置未誘導組和空載體為對照。前期SDS-PAGE分析得知牛冠狀病毒最佳表達條件是終濃度1 mmol/L IPTG 37 ℃繼續培養6 h，且該蛋白為上清表達。對誘導得到的菌液離心、洗滌，加入適量磷酸鹽緩沖液懸浮菌體，超聲法裂解細菌，離心保留上清溶液。使用康為世紀可溶性蛋白純化試劑盒對上清中的目的蛋白進行純化，為提高純化效率，利用試劑盒中原有Binding Buffer(NP-10)和Elution Buffer(NP-500)按一定比例配置咪唑為40 mmol/L的Binding Buffer(NP-40)。先用10倍柱體積的NP-10平衡層析柱，隨后將N蛋白進行掛柱，再用10倍柱體積的NP-40將多余雜蛋白洗去，最后用NP-500把目的蛋白洗脫下來，洗脫流速為1 mL/min。前3滴洗脫液棄去，其他洗脫液需收集保存進行檢測。取50 μL純化的蛋白與10 μL 6×上樣緩沖液混勻，煮沸10 min，然后進行SDS-PAGE檢測純化結果，純化得到的蛋白可長時間保存在-80 ℃。

1.2.3 N蛋白核酸適配體的篩選 將N蛋白包被在ELISA酶標板上，4 ℃過夜；倒掉包被液后用HEPEST洗3次并拍干；加入含有3%的BSA的HEPES，37 ℃封閉2 h；HEPEST洗滌后，加入適配體文庫孵育2 h，再洗4次；加核酸洗脫液，采用酚抽提法提取洗脫液中的適配體；最后對適配體分別進行一輪對稱和非對稱PCR(對稱PCR體系為2×Mix 25 μL，WZ-02 1 μL，WZ-04 1 μL，適配體 3 μL，去離子水 20 μL；反應程序為95 ℃ 10 min，95 ℃ 20 s，65 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，72 ℃ 5 min，共15個循環。非對稱PCR體系為2×Mix 25 μL，WZ-02 1 μL，WZ-04 0.02 μL，適配體 5 μL，去離子水 19 μL；非對稱PCR反應程序與對稱PCR基本相同，循環設為28次)。純化的適配體由小片段DNA膠回收試劑盒收集。為了避免非特異性結合，第5輪起執行反篩操作：在包被時設置無N蛋白包被液的反篩孔，其他步驟不變。

1.2.4 核酸適配體序列測定 最后一輪篩選出的適配體PCR產物(84 bp)連接到T載體(約160 bp)上，并把得到的連接產物(約240 bp)轉化DH5а感受態細胞，37 ℃搖床培養1～2 h，經離心濃縮后取200 μL涂在卡那抗性LB固體平板上，置37 ℃溫箱培養18 h。使用通用引物M13R和M13F擴增平板上的白色單菌落，經電泳挑選出條帶大小符合預期的PCR產物送公司測序。

1.2.5 間接酶聯適配體試驗(I-ELAA)測定適配體KD值 先對第11輪篩選并測序成功，且重復頻率高的3條適配體(N-12、N-33和N-45)在5′端進行生物素標記，再使用I-ELAA法測定各條適配體的親和力。首先，將0.5 mg/mL的N蛋白包被酶標板，4 ℃冰箱過夜，次日使用HEPEST洗板3次，加入1% BSA，37 ℃封閉2 h，向孔中加入0～100 nmol/L不同濃度的Bio-aptamer，37 ℃作用1 h后重復洗板5次，然后向孔中加入1∶6000稀釋的二抗 HRP-SA，37 ℃作用1 h，洗板后顯色，用酶標儀測定每孔450 nm處吸光光度值(OD)大小。根據公式Y=Bmax/(KD+X)計算每條適配體KD值。其中Y是OD450平均值；Bmax是OD450最大值；X是適配體濃度。

1.2.6 核酸適配體二級結構預測 將測序結果在核酸結構預測軟件MFOLD分析其二級結構，軟件網址為http://mfold.rit.albany.edu。

2 試驗結果

2.1 牛冠狀病毒N蛋白編碼基因的擴增

使用合成的引物對N蛋白編碼基因進行PCR擴增，將獲得的PCR產物上樣、電泳，獲得約1 363 bp的目的條帶，與預期結果相符，說明成功擴增出N蛋白編碼基因，見圖1。

2.2 目的蛋白的誘導表達及SDS-PAGE檢測

加入IPTG誘導6 h后，經SDS-PAGE檢測，成功在上清中表達出相對分子質量約為55 kD的目的蛋白，見圖2。

2.3 N蛋白適配體的篩選

利用微孔板法對N蛋白的適配體進行篩選，共篩選11輪。使用引物WZ-02和WZ04對篩選出的適配體進行PCR擴增，配制2%瓊脂糖凝膠并將對稱PCR產物和非對稱PCR產物上樣電泳。凝膠成像儀顯示擴增產物約84 bp，大小符合預期。部分PCR結果見圖3和圖4。

2.4 菌液PCR鑒定及序列測定

菌液PCR擴增產物的電泳結果見圖5。將第11輪篩選的PCR產物與T載體連接后轉化的DH5а感受態細胞涂板培養，使用M13F和M13R通用引物對135個單菌落進行PCR擴增，擴增產物

編號Number核酸隨機序列Random sequence of nucleic acid重復次數RepeatN-12TAAAGCAACACGAATCCCCACACAGACATCGAAATGCGG8N-33ATTAAAAAACATTGGACTATAAACATGTATTGCCCGGTGC14N-45GGCCTGCGTCATTTCACTTGCGCTGCCATTATCTTCTCTC11

進行瓊脂糖凝膠電泳，鑒定出123個陽性克隆，部分PCR電泳如圖5所示。提取123個菌液的質粒送樣測序，共測出67條序列，其中N-12、N-33和N-45重復次數較多，說明這3條適配體對N蛋白具有較高的親和力，其核苷酸序列見表2。

2.5 適配體KD值測定

適配體N-12、 N-33和 N-45出現的頻率較高，故使用I-ELAA試驗對其KD值進行測定(表2)。使用軟件GraphPad Prism 5.0處理數據，公式Y=Bmax/(KD+X)算出3條核酸適配體KD值分別為32.81 nmol/L±4.75 nmol/L、19.61 nmol/L±8.36 nmol/L和21.01 nmol/L±5.48 nmol/L，其中N-12的KD值較高。此3條核酸適配體KD值均在納摩爾級，符合試驗要求。

2.6 適配體二級結構預測

使用在線軟件預測適配體N-12、N-33和N45的二級結構，結果如圖6所示，3條特異性適配體均具有各式的環狀、發卡狀結構。

3 討 論

對牛冠狀病毒病檢測技術而言，檢測的靈敏度、特異性、穩定性、成本及操作方法的簡便性等方面非常重要。基于抗體的酶聯免疫檢測技術，在抗體的提取和純化上存在步驟煩瑣、成本高、不穩定、制備時間長等缺點。而與抗體相比，核酸適配體既可人工快速合成，而且在高溫等條件下更加穩定，能在變性和復性中保持功能[9-10]。此外核酸適配體具有低免疫原性、易于化學修飾、低成本的良好特性。適配體具備如此多的優勢，有望替代抗體建立新的疾病檢測方法。為了探索新的經濟有效的牛冠狀病毒病診斷方法，該試驗基于核酸-蛋白特異性結合原理，利用原核表達系統和SELEX，對核衣殼蛋白的核酸適配體進行篩選。經微孔板法多次、反向篩選最終得到多條與N蛋白特異性結合的適配體。其中N-12、N-33和N-45這3條適配體序列重復率較高。適配體篩選有多種方法，該研究中選用微孔板法進行篩選，雖然耗時較長但對靶分子、儀器的要求低，低成本條件下仍能獲得特異性適配體。核酸適配體通過形成特定的二級結構如發夾、環狀、凸起、G4聚體等與靶分子特異性結合，達到識別目的[11]。該研究中所得N-12、N-33和N-45適配體均具有結構各式的環狀和發卡結構，與牛冠狀病毒N蛋白空間結構上特異性結合。故N-12、N-33和N-45在牛冠狀病毒病檢測方面具有應用潛能，后續將使用N-12、N-33和N-45適配體，優化和建立一種酶聯適配體的檢測方法，為牛冠狀病毒病的早期快速診斷奠定基礎。