棗瘋植原體免疫優勢膜蛋白基因imp-DZ的克隆與原核表達

董雅容，楊 靜，寧鈞暉，王進忠，王 合，田國忠，任爭光*

(1. 北京農學院農業農村部華北都市農業重點實驗室，北京 102206；2. 北京市林業保護站，北京 100029；3. 中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所，北京 100091)

植原體(Phytoplasma)原稱類菌原體(Mycoplasma-like organism，MLO)，是一種重要的原核生物植物病原菌[1]。植原體隸屬軟壁菌門(Tenericutes)，柔膜菌綱(Mollicutes)，候選植原體屬(CandidatusPhytoplasma)，其主要特征是缺乏細胞壁，只有細胞膜包被[2-3]。植原體主要存在于植物韌皮部中的篩管細胞和介體昆蟲的淋巴、腸道、唾液腺等組織內，能夠引起多種農作物、園藝作物和園林植物病害，導致植物產生叢枝、黃化、花變葉、帶化等癥狀，嚴重者造成植物死亡[4]。中國報道的植原體相關病害有100余種，危害嚴重的主要有棗瘋病(Jujube witches’ broom，JWB)、泡桐叢枝病(Paulownia witches’ broom，PaWB)和桑萎縮病(Mulberry drawf，MD)等[5-6]。棗瘋病是棗樹生產上最嚴重的自然災害，棗樹一旦得病將終生帶病，并具有強傳染性、難以治愈，高致死性的特點，被稱為棗樹的“癌癥”[7]。植原體與寄主的互作關系是植原體病理學研究的核心問題，由于沒有細胞壁，植原體分泌的蛋白和膜蛋白直接接觸寄主植物和昆蟲細胞。Clark等[8-9]研究發現植原體表面參與膜組成的幾種蛋白具有免疫優勢活性，稱之為免疫膜蛋白。目前的研究表明，植原體膜上發揮互作功能的免疫膜蛋白主要有3種，即免疫優勢膜蛋白(immunodominant membrane protein，Imp)，免疫優勢膜蛋白A(immunodominant membrane protein A，IdpA)和抗原膜蛋白(antigenic membrane protein，Amp)，其中Imp蛋白可以識別寄主植物的肌動蛋白并與之結合，幫助植原體固定在寄主植物篩管分子表面，Amp蛋白則能與傳播昆蟲的肌動蛋白和肌球蛋白互作，從而利于植原體的傳播[10-11]。雖然這3種蛋白在植原體中普遍存在，但是它們之間在氨基酸序列上沒有相似性，不同組別的植原體之間的同一免疫膜蛋白氨基酸序列差異也很大[12]。

研究前期對棗瘋病植物樣本進行了高通量測序，獲得大量棗瘋植原體序列，通過篩選得到編碼免疫優勢膜蛋白的基因imp-DZ。該研究對imp-DZ基因進行了克隆，并探索Imp-DZ蛋白的異源表達情況，為下一步深入研究棗瘋植原體致病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

棗瘋病樣品采集自北京市昌平區發病冬棗樹上。植物基因組DNA提取試劑盒，pBM30快速克隆試劑盒購自北京博邁德生物技術有限公司。菌株EscherichiacoliBL21(DE3)和E.coliDH5α，DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒，His標簽蛋白純化試劑盒購自寶日醫生物技術(北京)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 棗瘋植原體imp-DZ基因序列分析 根據北京農學院農業農村部華北都市農業重點實驗室前期對棗瘋病植物樣品總DNA高通量測序結果(數據未發表)，篩選出棗瘋植原體JWB-Dongzao編碼免疫優勢膜蛋白基因imp-DZ的完整序列。將該序列在NCBI網站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中用Blastn軟件進行比對分析，并下載其他植原體imp基因相關序列，利用DNAMAN5.0軟件進行基因完全比對，用MEGA 5.2軟件構建系統進化樹。

1.2.2 免疫優勢膜蛋白Imp-DZ特征分析 用DNAMAN5.0軟件對imp-DZ基因編碼的氨基酸序列進行翻譯，用SignalIP4.1在線預測軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalIP/)對Imp-DZ蛋白的信號肽進行分析，用TMHMM v2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對Imp-DZ蛋白的跨膜區進行預測。

1.2.3 植物總DNA的提取 取0.1 g患棗瘋病棗樹(冬棗)幼嫩葉片，用液氮研磨成粉末，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取總DNA，溶解在無菌水中，-20 ℃保存備用。

1.2.4imp-DZ基因引物設計與PCR擴增 根據1.2.2中Imp-DZ蛋白跨膜區預測結果，設計用于PCR擴增完整imp-DZ基因序列(不包含終止密碼子)引物Imp-F(5′-CACCATGAGAGGAAAGAA GAAAATGC-3′)和Imp-R (5′-TTTGTTAATAACTGCAATTGCTG-3′)；同時設計引物Imp-F2(5′-CACCAAAGAAGTTTGGCCATTCG-3′)與Imp-R配對用于擴增去掉跨膜區核苷酸的imp-DZ基因部分序列。PCR反應體系和PCR反應條件參見文獻[5]。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用DNA瓊脂糖凝膠純化試劑盒純化回收。

1.2.5imp-DZ基因克隆與異源表達 將1.2.4中回收的2個DNA片段連接到蛋白表達載體pBM30上，轉化至E.coliDH5α中，將陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。挑選測序正確的質粒轉入大腸桿菌E.coliBL21(DE3)中，獲得重組菌。將重組菌接入含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37 ℃，150 r/min振蕩培養3～5 h，菌液OD600值達到0.6～0.8時，加入IPTG(50 μg/mL)誘導表達6～8 h。將誘導好的菌液在12 000 r/min離心1 min，收集菌體，加入蛋白上樣緩沖液，沸水中煮5 min，置于冰上備用，即為樣品總蛋白，同時用His標簽蛋白純化試劑盒對總蛋白進行純化。樣品總蛋白用15% SDS-PAGE電泳檢測。

2 結果與分析

2.1 棗瘋植原體imp-DZ基因序列分析結果

前期利用二代測序技術，對棗瘋病樣品(冬棗)總DNA進行測序，去除棗樹DNA序列后，獲得大量棗瘋植原體JWB-Dongzao的序列，通過篩選基因注釋結果，找到編碼產物為免疫優勢膜蛋白的基因imp-DZ，基因大小459 bp。將該基因序列放入NCBI數據庫中進行核酸比對分析，imp-DZ與棗瘋植原體Jwb-nky全基因組(GenBank登錄號：CP025121)中一個編碼假定蛋白(hypothetical protein)的基因核苷酸一致性(identity)為96%。下載其他植原體的imp基因序列，進行全基因和編碼氨基酸序列比對分析(表1)。imp-DZ基因序列僅與同組(16SrV)的葡萄黃化植原體FD-C Piemonte和FD-D，榆樹黃化植原體ULW的imp基因核苷酸一致性在56%左右，氨基酸一致性在30%以上，與其他植原體imp基因一致性均低于50%，說明不同植原體imp基因間的差異非常大。利用MEGA 5.2軟件構建imp基因的系統發育樹(圖1)，JWB-Dongzao的植原體與16SrV組植原體聚在一個大的分枝上，說明imp基因仍具有一定的保守性。

表1 imp-DZ基因與其他植原體imp及相關基因一致性比較結果Tab.1 The consistency comparison of imp-DZ gene with other phytoplasma imp genes

注：棗瘋植原體Jwb-nky為編碼假定蛋白(hypothetical protein)基因。

Note: The gene of Jwb-nky phytoplasma was hypothetical protein gene.

2.2 Imp-DZ蛋白特征分析結果

用DNAMAN5.0軟件對植原體JWB-Dongzao的imp-DZ基因進行翻譯，獲得152個氨基酸序列，分子量大小約為16.8 kD，等電點10.35。將Imp-DZ的氨基酸序列用SignalIP4.1軟件進行分析，Imp-DZ不具有信號肽(數據未顯示)。用TMHMM v2.0軟件對Imp-DZ的跨膜區進行預測(圖2)，Imp-DZ蛋白具有一個明顯的跨膜區，跨膜區起始位置為第21個到第42個氨基酸(aa)；1-20 aa為疏水區域在細胞內部，43-152 aa為親水區域在細胞外部。

2.3 imp-DZ基因的PCR擴增與克隆

利用引物對Imp-F/Imp-R和Imp-F2/Imp-R分別對imp-DZ的完整基因(去除終止密碼子，大小456 bp)和去除編碼跨膜區的核酸序列(去除前126個核苷酸和終止密碼子，大小330 bp)進行PCR擴增，電泳檢測結果見圖3。擴增產物均在200～500 bp之間，和預計值大小相當。將兩個PCR擴增片段(分別命名為I4和I3)克隆到蛋白表達載體pBM30上，陽性克隆送公司測序，測序結果經比對分析發現與高通量測序結果一致，分別得到重組質粒pBMI4和pBMI3。

2.4 Imp-DZ蛋白的異源表達結果

將重組質粒pBMI4和pBMI3分別轉入菌株E.coliBL21(DE3)中，在LB液體培養基中培養6 h，分別加入IPTG后立即取菌體和誘導6 h后取菌體。菌體裂解后SDS-PAGE檢測表達蛋白，結果見圖4。與IPTG誘導0 h的蛋白相比，含有pBMI4的重組菌體誘導6 h后并沒有出現過量表達的蛋白，而包含pBMI3的重組菌體在誘導6 h后在15～25 kD之間靠近15 kD處出現表達量明顯增多的條帶，大小和預計的融合蛋白一致(去除跨膜區后加上載體融合序列蛋白的大小為19 kD)；將包含pBMI3的重組菌體蛋白用His標簽蛋白純化試劑盒純化回收，在同一位置有單一蛋白條帶出現。說明克隆完整imp-DZ基因的重組質粒(pBMI4)在大腸桿菌中并沒有表達，而去掉跨膜區后(pBMI3)，Imp-DZ蛋白得到大量表達。

3 討 論

該研究從棗瘋植原體JWB-Dongzao(16SrV組B亞組)的高通量測序結果中篩選到免疫優勢膜蛋白編碼基因imp-DZ，與imp-DZ基因序列一致率最高的是16SrV組A亞組的榆樹黃化植原體ULW，C亞組的葡萄黃化植原體FD-C Piemonte和FD-D，但氨基酸一致率僅有30%左右，由此可見Imp蛋白在不同亞組成員之間仍存在著較大差異。利用imp基因核苷酸序列構建系統樹，棗瘋植原體同16SrV組其他植原體聚在一起，說明16SrV組植原體的imp基因仍具有共同的起源。

植原體的3種免疫膜蛋白(Imp、IdpA、Amp)雖然在氨基酸水平上無相似性，但有一些共同的特點，即都是鑲嵌在細胞膜上的蛋白，靠近兩端(N端和C段)有疏水區域構成的跨膜區。不同的是Imp蛋白一般具有一個跨膜區，靠近N端，C端是親水區域裸露在細胞外部，而IdpA和Amp兩端具有2個跨膜區，中間部分為親水區域在細胞外部[13]。然而，正是由于這些跨膜區的存在影響免疫膜蛋白的異源表達。例如岳紅妮等[14]在用原核表達系統對泡桐叢枝植原體PaWB-Shaanxi的Amp蛋白進行表達過程中發現，表達免疫膜蛋白全長基因和切除C端的跨膜區均未檢測到相應表達蛋白。牟海青等[15]只克隆泡桐叢枝植原體抗原膜蛋白amp基因中間編碼親水區域的核苷酸片段進行異源表達，結果成功表達相應的蛋白。同樣的，在E.coli中表達Imp的完整蛋白時，大腸桿菌的生長受阻，表達出的蛋白較少或無法表達出蛋白，而去掉跨膜區后能成功高表達Imp蛋白[10,12]。該試驗結果也證實這一現象，棗瘋植原體JWB-Dongzao的Imp-DZ具有一個跨膜區，無外泌信號肽，只有去掉跨膜區后才能成功表達出Imp-DZ蛋白。這種現象可能與植原體跨膜蛋白對大腸桿菌具有毒性有關，過量表達疏水膜蛋白可能導致大腸桿菌膜蛋白合成途徑飽和，導致大腸桿菌因ATP合成不足而死亡[16]。也有研究顯示表達攜帶跨膜區的Imp蛋白主要以包涵體形式存在，另外溫度，加入IPTG時大腸桿菌的濃度，IPTG的終濃度和誘導時間都會影響Imp蛋白的表達量[17]。

該研究對棗瘋植原體的免疫膜蛋白imp-DZ基因進行克隆，對基因和蛋白編碼序列進行分析，并在大腸桿菌中成功表達Imp-DZ蛋白，為后續特異性抗體制備和開發植原體免疫檢測方法奠定基礎，也為進一步了解植原體與寄主植物互作機理提供依據。