蘋(píng)果屬植物DNA去甲基化基因MdIDM1參與低溫促進(jìn)花色素苷的積累

孫玉瑩，于璐佳，張 杰

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102206)

觀賞海棠(Maluscrabapple)是蘋(píng)果屬植物中兼具觀賞價(jià)值和經(jīng)作價(jià)值的重要資源[1-2]。具有抗逆能力強(qiáng)、葉幕較大、花果葉多彩等特點(diǎn)，不僅作為觀賞樹(shù)種、環(huán)城林帶建設(shè)樹(shù)種用于美化城鄉(xiāng)環(huán)境，也作為造林樹(shù)種用于治理山區(qū)水土流失、風(fēng)沙侵蝕等自然災(zāi)害。觀賞海棠果實(shí)和葉片中含有極為豐富的天然花色素苷[3-5]，是植物體內(nèi)一類重要的次級(jí)代謝產(chǎn)物，屬于類黃酮物質(zhì)并具有良好的抗氧化功能。花色素苷存在于高等植物的所有組織和器官中，使植物組織和器官呈現(xiàn)多種顏色，如紅色、藍(lán)色和紫色等[6-7]。同時(shí)，花色素苷在生物學(xué)功能及保健功能方面也具有多種用途，如改善視力、防止老年癡呆、預(yù)防心血管及腫瘤和糖尿病等疾病的發(fā)生[8-9]。

研究表明，低溫誘導(dǎo)能夠促進(jìn)植物組織積累花色素苷[10-11]。適當(dāng)?shù)牡蜏乜梢源龠M(jìn)植物中花色素苷的積累，但是過(guò)低的溫度不僅不會(huì)正向影響花色素苷的積累還會(huì)對(duì)植物造成損傷，影響其生長(zhǎng)發(fā)育[12]。這是由于過(guò)低的溫度會(huì)影響花色素苷生成途徑中合成酶和調(diào)節(jié)蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，降低其活性，減少花色素苷的積累[13]。低溫促進(jìn)植物中一些花色素苷合成基因和調(diào)節(jié)因子的轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而提高花色素苷的含量。如低溫可以促進(jìn)花色素苷代謝途徑中的PAL、CHS、CHI、F3H、DFR、ANS和UFGT等基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花色素苷積累[14]。蘋(píng)果屬植物中，低溫能夠誘導(dǎo)MdbHLH3基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MdbHLH33蛋白與MdMYBl轉(zhuǎn)錄因子的互作，激活花色素苷關(guān)鍵合成基因的表達(dá)，促進(jìn)低溫誘導(dǎo)下的花色素苷積累[15-16]。

當(dāng)植物受到非生物脅迫時(shí)，為適應(yīng)環(huán)境變化，抗逆相關(guān)基因啟動(dòng)子往往會(huì)發(fā)生去甲基化，釋放沉默基因并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以提高植物對(duì)非生物脅迫的適應(yīng)性[17]。IDM1最早在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，編碼一種組蛋白H3乙酰轉(zhuǎn)移酶(histone H3 acetyltransferase)；在DNA去甲基化過(guò)程中，其通過(guò)自身MBD結(jié)構(gòu)域識(shí)別甲基化的DNA，并通過(guò)PHD結(jié)構(gòu)域識(shí)別組蛋白H3K4而產(chǎn)生乙酰化的H3K23和H3K18標(biāo)記，隨后被DNA去甲基化酶或其互作蛋白所識(shí)別而使DNA去甲基化[18]。IDM1在生物體內(nèi)的正常表達(dá)對(duì)于維持DNA甲基化狀態(tài)，防止超甲基化具有非常重要的作用[19-20]。

低溫脅迫促進(jìn)DNA去甲基化，同時(shí)促進(jìn)植物體內(nèi)的花色素苷的積累，但蘋(píng)果屬植物中DNA去甲基化與花色素苷積累間是否存在聯(lián)系尚不清晰。該研究的目的旨在探索低溫條件下IDM1基因參與DNA去甲基化過(guò)程與花色素苷合成途徑的潛在聯(lián)系，初步探明DNA去甲基化基因與蘋(píng)果屬植物低溫誘導(dǎo)花色素苷積累的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為蘋(píng)果品種‘嘎啦’(Malusdomesticacv. ‘Gala’)、觀賞海棠常紅葉品種‘王族’(Maluscv. ‘Royalty’)和觀賞海棠常綠葉品種‘火焰’(Maluscv. ‘Flame’)組培苗。組培苗試驗(yàn)材料均來(lái)自北京農(nóng)學(xué)院組培中心，其外植體于2019年4月12日取自北京農(nóng)學(xué)院蘋(píng)果屬植物種質(zhì)資源圃的一年生枝，培養(yǎng)于MS培養(yǎng)基[21]，光照時(shí)間為光照16 h/黑暗8 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx[22-23]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 低溫脅迫處理 對(duì)照組培養(yǎng)溫度為23～26 ℃，低溫處理組培養(yǎng)溫度為16 ℃，連續(xù)處理7 d。

1.2.2 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄cDNA 將處理后的觀賞海棠常紅葉品種‘王族’、觀賞海棠常綠葉品種‘火焰’和蘋(píng)果品種‘嘎啦’組培苗葉片對(duì)照組和16 ℃低溫處理組分別進(jìn)行植株葉片液氮研磨，每組處理進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。將每個(gè)研磨樣品進(jìn)行總RNA提取，提取方法參照RNA多糖多酚提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)說(shuō)明書(shū)；利用第一鏈反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)將每個(gè)樣品進(jìn)行cDNA合成。

1.2.3MdIDM1基因的克隆 通過(guò)NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)檢索，獲得金冠基因組同源IDM1基因堿基序列，使用Primer.5軟件根據(jù)其堿基序列設(shè)計(jì)克隆引物MdIDM1-F為5′-ATGTTTCTCAGCAAAGAAATTG-3′，MdIDM1-R為5′-TTATTCTTCCAAAGGAAGCTG-3′。PCR擴(kuò)增體系參考Pfu DNA Polymerase說(shuō)明書(shū)(北京博邁德基因技術(shù)有限公司)，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性20 s；60 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s；循環(huán)數(shù)35；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物電泳檢測(cè)、回收并測(cè)序(上海生工生物工程有限公司)。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè) 根據(jù)測(cè)序獲得的IDM1基因堿基序列，利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中Primer-BLAST，特異性設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物。q-IDM1-F為5′-TATCCAGCCATCGGAGGGAA-3′，q-IDM1-R為5′-CGCCCGTCGCTATTTCCTAA-3′。以16 ℃低溫處理組cDNA及對(duì)照組cDNA分別為模板，使用TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)熒光染料(北京擎科新業(yè)生物有限公司)于Bio-RAD CFX384 Thermal Cycler上進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)，檢測(cè)去甲基化基因MdIDM1以及花色素苷代謝過(guò)程中合成基因和調(diào)節(jié)基因的表達(dá)量。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，65 ℃延伸30 s，共循環(huán)35次；最后65～95 ℃制備溶解曲線。以蘋(píng)果18S核糖體RNA基因(DQ341382)作為內(nèi)參基因，每組處理設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)樣品進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)。

1.2.5 花色素苷物質(zhì)含量測(cè)定 以甲酸∶甲醇∶水=1∶80∶19配制成花色素苷提取液。液氮研磨的植株葉片樣品，分別將每個(gè)樣品稱量1 g于離心管中加入2 mL花色素苷提取液，45 ℃超聲1 h，12 000 g離心10 min，以直徑0.2 μm的濾膜過(guò)濾上清于棕色小瓶中。將花色素苷提取液進(jìn)行液相色譜成分檢測(cè)(Agilent 1200，北京農(nóng)學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室)，并計(jì)算含量。花色素苷含量計(jì)算公式：花色素苷的含量(μg/g) =(0.003×A+0.3)/m。A表示峰面積，m表示樣品鮮質(zhì)量(g)[ 24-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdIDM1基因的克隆

以cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、回收及測(cè)序等過(guò)程，得到1條長(zhǎng)度為3 975 bp的MdIDM1基因序列，與‘金冠’(Malusdomestica‘Golden Delicious’)基因組MdIDM1基因進(jìn)行對(duì)比，核苷酸相似度99.75%(圖1)；氨基酸相似度99.47%(圖2)。在NCBI上進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，顯示MdIDM1蛋白存在保守的PHD1結(jié)構(gòu)域(圖3)。

2.2 低溫處理蘋(píng)果屬葉片的花色素苷含量分析

為了解低溫條件下蘋(píng)果屬植物花色素苷含量變化情況，對(duì)低溫處理后的‘嘎啦’‘王族’和‘火焰’3個(gè)品種的表型進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4A所示。常綠品種‘嘎啦’和‘火焰’植株葉片明顯變紅，紅葉品種‘王族’經(jīng)低溫處理后葉片變成紫紅。利用液相色譜技術(shù)對(duì)不同處理組的3個(gè)品種的葉片進(jìn)行花色素苷含量測(cè)定，‘嘎啦’‘王族’和‘火焰’葉片經(jīng)16 ℃低溫處理后，花色素苷含量顯著升高，花色素苷在3個(gè)品種中的含量都呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(圖4B)。

2.3 低溫處理蘋(píng)果屬葉片花色素苷合成相關(guān)基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)測(cè)定3個(gè)品種葉片中花色素苷合成相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量，16 ℃低溫處理后花色苷合成相關(guān)基因的表達(dá)都有不同程度的升高(圖5)。在‘嘎啦’中，MdCHI、MdDFR、MdFLS和MdUFGT基因的表達(dá)量上調(diào)10倍以上。‘王族’中MdF3’H基因的表達(dá)水平上調(diào)最為顯著；其次MdCHI基因表達(dá)量上升6.7倍，MdMYB10的表達(dá)量上升了4.7倍，MdUFGT表達(dá)量上升了3.3倍。在‘火焰’中MdF3’H、MdFLS、MdCHI、MdUFGT的表達(dá)量顯著升高，其中MdF3’H表達(dá)量上升了142倍，MdFLS表達(dá)量上升了30倍，MdUFGT和MdCHI的表達(dá)量上升14倍，MdDFR和MdANS的表達(dá)量分別上升8.5倍和8.7倍。

2.4 低溫處理蘋(píng)果屬葉片MdIDM1基因表達(dá)分析

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)3個(gè)品種葉片中MdIDM1基因的相對(duì)表達(dá)量。MdIDM1基因在3個(gè)品種中的表達(dá)量都呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，均升高2倍左右，與‘王族’品種中花色素苷含量上升趨勢(shì)相同(圖6)。

3 討 論

花色素苷是植物中重要的次生代謝產(chǎn)物，是苯丙酸代謝途徑的產(chǎn)物之一。花色素苷使植物呈現(xiàn)不同顏色，有利于植物繁衍后代，也利于植物抵御非生物脅迫。研究表明蘋(píng)果中MdMYB1、MdMYBA、MdMYB10和MdMYB110a等MYB轉(zhuǎn)錄因子，結(jié)合MdCHS、MdDFR和MdANS等花色素苷生物合成基因的啟動(dòng)子，調(diào)控其表達(dá)的強(qiáng)弱。蘋(píng)果屬植物觀賞海棠中MdMYB10基因能夠響應(yīng)低溫、持續(xù)光照的誘導(dǎo)，調(diào)節(jié)MdCHS、MdF3H、MdF3’H、MdDFR和MdANS等花色素苷生物合成基因表達(dá)[5]。低溫條件下，蘋(píng)果‘嘎啦’和觀賞海棠‘王族’及‘火焰’3個(gè)品種的葉片明顯變紅，通過(guò)液相色譜分析，花色素苷含量明顯升高，qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明花色素苷生物合成基因表達(dá)明顯升高。

DNA去甲基化是植物體內(nèi)重要的表觀遺傳學(xué)修飾途徑，DNA去甲基化可以釋放基因沉默，其與DNA甲基化動(dòng)態(tài)變化，增強(qiáng)植物體內(nèi)基因組的可塑性，也使植物在受到低溫脅迫時(shí)做出響應(yīng)[26-27]。低溫影響植物的生長(zhǎng)和發(fā)育。當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，促進(jìn)花色素苷的積累來(lái)防御低溫對(duì)植物造成的傷害[28]。同時(shí)植物體內(nèi)甲基化水平降低，大部分基因去甲基化，雖然不是直接調(diào)控低溫脅迫途徑相關(guān)基因，但是間接影響基因的表達(dá)[29-30]。植物為抵御溫度的變化，會(huì)通過(guò)DNA甲基化和DNA去甲基化的表觀遺傳過(guò)程修飾基因表達(dá)，從而促成環(huán)境誘導(dǎo)的表型變異。已有研究表明，低溫春化的小麥[31]和油菜[32]種子中DNA甲基化水平降低，并且會(huì)出現(xiàn)永久的DNA去甲基化現(xiàn)象。低溫處理橡膠樹(shù)苗，發(fā)現(xiàn)低溫敏感基因HbICE1、HbCBF2和HbMET啟動(dòng)子低甲基化，并且許多去甲基化位點(diǎn)發(fā)生在低溫相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別的順式元件上，通過(guò)對(duì)基因組分析得到12個(gè)DME基因、2個(gè)ROS基因和7個(gè)DML基因，其中HbROS1受低溫誘導(dǎo)表達(dá)量增高[33]，因此低溫誘導(dǎo)DNA糖基化酶的轉(zhuǎn)錄激活，通過(guò)DNA去甲基化途徑使冷敏感相關(guān)基因的啟動(dòng)子甲基化水平降低，提高基因表達(dá)，增加植物對(duì)低溫脅迫的耐受性。

筆者克隆獲得蘋(píng)果屬植物MdIDM1基因，并通過(guò)對(duì)蘋(píng)果屬3個(gè)品種植物進(jìn)行低溫處理，發(fā)現(xiàn)低溫處理能夠促進(jìn)蘋(píng)果屬植物花色素苷積累，且DNA去甲基化基因表達(dá)與花色素苷積累和花色素苷生物合成基因表達(dá)趨勢(shì)一致，推測(cè)低溫脅迫通過(guò)誘導(dǎo)MdIDM1基因的表達(dá)，降低花色素苷合成途徑中關(guān)鍵基因啟動(dòng)子的甲基化水平，從而增加蘋(píng)果屬植物葉片和果實(shí)中合成基因的表達(dá)，促進(jìn)花色素苷的積累。MdIDM1基因在蘋(píng)果屬花色素苷合成上的作用機(jī)制還需進(jìn)一步借助于基因過(guò)表達(dá)或沉默等轉(zhuǎn)基因技術(shù)的驗(yàn)證。