尼古丁誘發動脈粥樣硬化機制的最新研究進展#

林澤帆 高分飛

（1.汕頭大學醫學院臨床醫學系，廣東 汕頭 515041；2.汕頭大學醫學院藥理學教研室，廣東 汕頭 515041）

大量證據表明吸煙與多種疾病有關，包括惡性腫瘤、心肺疾病和腦血管意外等[1-3]。據世界衛生組織估計，吸煙導致全球每年大約6萬人死亡，預計死亡人數將在2030年增加到800萬[4]。為了解煙草相關疾病的病理生理學機制，并闡明煙草煙霧引起疾病的機制，全世界在過去的幾十年中進行了廣泛的研究。

在心血管疾病日益成為健康重要殺手的今天，吸煙與心血管疾病的關系也成為了研究的重要課題之一。在一項研究吸煙與外周動脈疾病的薈萃分析中，與吸煙相關的外周動脈疾病的RR值為2.71（95%CI：2.28-3.21，P<0.001）[5]。研究發現吸煙顯著增加了急性冠狀動脈和腦血管疾病（包括心肌梗塞、中風和猝死）的風險。另外也有研究表明吸煙會加速冠狀動脈、主動脈、頸動脈和腦動脈以及外周循環中產生早期動脈粥樣硬化[6]。

傳統香煙煙霧包含的成分達到7,000種以上，其中尼古丁是主要成分[7]。在美國一項國家肺部篩查試驗中發現，與非尼古丁依賴性吸煙者相比，尼古丁依賴性吸煙者發生動脈粥樣硬化的OR值為0.24（95%CI 為0.08至0.69），說明尼古丁依賴是引起動脈粥樣硬化的獨立危險因素[8]。煙草中的尼古丁進入人體后通過作用于煙堿乙酰膽堿受體（Neuronal nicotinic acetylcholine receptors，nAChRs)而發揮作用。相關研究表明，nAChRs在心血管系統幾乎所有細胞（包括內皮細胞、巨噬細胞、T細胞等）中普遍表達，且非神經元nAChRs（如血管nAChRs）與中樞神經系統中的nAChRs結構極為相似[9-12]。盡管已有研究探討了吸煙與動脈粥樣硬化之間的聯系，但尼古丁促動脈粥樣硬化作用的機制在很大程度上仍是推測性的。本文將就近年來有關尼古丁誘發動脈粥樣硬化機制的研究進展做一綜述。

1 動脈粥樣硬化成因

動脈粥樣硬化是一種常見的血管慢性疾病，其會導致位于大中型動脈的內膜出現動脈粥樣斑塊等局灶性病變。低密度脂蛋白（Low Density Lipoprotein，LDL）在內皮下滯留及其氧化修飾是動脈粥樣硬化的最初原因，氧化的低密度脂蛋白（Oxidized low density lipoprotein，Ox-LDL）通過誘導介導白細胞（單核細胞和T細胞）滾動和粘附的幾種細胞表面粘附分子的表達來激活內皮細胞。當內皮細胞被激活時，其會表達P-選擇素（P-selectin）、血管粘附分子1（Vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）、單核細胞趨化蛋白-1（Monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）、細胞間粘附分子-1（Intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1）、E-選擇素（E-selectin）和其他炎癥因子，吸引眾多淋巴細胞和單核細胞與內皮細胞結合并滲入動脈壁中[13]，其中單核細胞分化為巨噬細胞，并吞噬Ox-LDL形成泡沫細胞（早期脂肪條紋病變的標志）。激活的內皮細胞和巨噬細胞可分泌多種化學因子和生長因子作用于相鄰的平滑肌細胞，誘導其在內膜中增殖并合成細胞外基質，從而產生纖維斑塊[14]。在晚期動脈粥樣硬化中，大量巨噬細胞和其他炎性細胞因子滲入血管壁中，巨噬細胞可通過分泌基質金屬蛋白酶（Matrix metalloproteinase，MMP）降解斑塊中的膠原纖維并導致斑塊破裂、出血和血栓形成[13]。

2 尼古丁對細胞功能的影響

2.1 尼古丁與內皮細胞功能障礙

血管內皮細胞是各種生理刺激的重要整合者和轉化者，積極參與血管收縮-舒張、凝血-抗凝血等生理過程。由于內皮細胞在調節血管穩態中的關鍵作用，內皮損傷引起的內皮功能障礙通常是血管疾病發展的最早事件。大中動脈壁內皮細胞功能障礙是導致動脈粥樣硬化性心血管疾病的局部和全身表現的重要因素。

完整的內皮屏障取決于細胞骨架的收縮和內皮細胞間連接的完整性，這兩者都可能受到尼古丁的影響。內皮細胞屏障受肌動蛋白/肌球蛋白細胞骨架的嚴格調控，骨架的收縮由肌球蛋白輕鏈激酶（Myosin light chain kinase，MLCK）和Rho激酶（Rho kinase enzymatic activities）活性共同控制[15]。研究表明，尼古丁可以作為傳統香煙煙霧或電子煙煙霧的一部分在循環系統中吸收，并通過氧化應激激活P38絲裂原活化蛋白激酶（P38MAPK），進而導致神經酰胺釋放引起內皮屏障功能障礙，這是Rho激酶激活和細胞收縮的上游通路[16]。進一步研究表明尼古丁主要通過內皮細胞Rho激酶依賴性磷酸化作用抑制肌球蛋白磷酸酶1亞基（Myosin phosphatase target subunit 1，MYPT1），從而促進肌球蛋白輕鏈（Myosin light chain，MLC）磷酸化，增加肌動球蛋白的收縮信號達到破壞內皮屏障的作用[17]。而內皮間連接是由許多連接蛋白構成，包括緊密連接蛋白ZO-1/2（ Zonula occludens-1/ zonula occludens-2 ，ZO-1/2）。連接蛋白表達下降可能導致內皮間連接完整性的下降，因此被認為是導致內皮屏障功能障礙和內皮通透性過高的標志性事件[18，19]。共聚焦顯微鏡分析表明，服用尼古丁的小鼠可出現內皮間緊密連接破壞，表現為冠狀動脈內皮細胞ZO-1和ZO-2表達減少，而ZO-1/2減少可被Nlrp3炎性小體（ Nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat pyrin domain containing 3，NLRP3）基因缺陷阻止，其具體機制是尼古丁誘導內皮細胞溶酶體的損傷和組織蛋白酶B的釋放，進而促進Nlrp3炎性小體的聚集和激活以及炎性小體依賴性釋放的介導炎癥的高遷移率族蛋白B1 (High-mobility group box 1 protein，HMGB1)的表達[20]。最近的研究表明，HMGB1可通過晚期糖基化終末產物（RAGE）受體激活MAPK信號通路引起MMP-2和MMP-9過表達以及緊密連接蛋白ZO-1和緊密連接蛋白-5的表達降低進而增大內皮通透性，這表明Nlrp3炎性小體-HMGB1信號軸的激活可能是吸煙相關血管并發癥早期發展的重要觸發機制[21，22]。

在動物實驗中，飲食誘導的肥胖大鼠長期口服尼古丁后主動脈出現腫瘤壞死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）表達增加而一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）表達降低，且經尼古丁干預的肥胖大鼠腹膜巨噬細胞培養液可抑制內皮細胞eNOS表達并增加內皮細胞NADPH亞基gp91phox和p22phox的表達，這表明內皮功能障礙、血管氧化應激和血管炎癥與巨噬細胞釋放炎癥因子有關。[23]另外，經qRT-PCR和western blot檢測尼古丁可誘導人臍靜脈內皮細胞核轉錄因子肽NF-κB p65表達水平和核移位明顯增加。以往的研究已表明核轉錄因子NF-κB信號通路是炎癥的核心調控因子，其可以促進IκB激酶β（Inhibitor kappa B kinaseβ，IKKβ）、核因子kappaB p65（NF-κB p65）和抑制性κB蛋白（Ikppa Bα，IkBα）的表達[24]。

2.2 尼古丁與血管平滑肌細胞表型轉化、遷移

作為血管的組成成分，VSMC在動脈粥樣硬化形成中扮演重要角色。越來越多的證據表明，在局部微環境中，VSMC對損傷性刺激具有顯著的表型可塑性。[25]。隨著病變的發展，VSMC向內膜的遷移和增殖有助于纖維帽的形成[26]。同時VSMC會通過自分泌或旁分泌的方式分泌促炎、促增殖細胞因子激活VSMC并將巨噬細胞募集到損傷部位[27]。最新研究還認為VSMC可通過其細胞膜表面表達的脂蛋白受體攝取脂質，形成肌源性泡沫細胞[28]。

2.2.1 VSMC表型轉化

在正常狀態下，VSMC增殖水平低，并具有低合成活性。然而，在發生動脈粥樣硬化慢性炎癥時，VSMC可發生異常調節，導致斑塊區VSMC脫分化，VSMC可從收縮型轉變為合成型，即發生表型轉化，從而獲得再增殖能力，并在增殖的同時合成與分泌大量細胞因子和細胞外基質[29]。

Yoshiyama等人研究發現經尼古丁處理的VSMC同工型肌球蛋白和肌動蛋白的表達水平表現出相似趨勢。合成型VSMC標志物（肌球蛋白II 10和β-肌動蛋白）的蛋白質水平增加，并且收縮型VSMC標志物（肌球蛋白II 11和α-肌動蛋白）表達沒有顯著變化[30]。而在Wang等人的研究中，經過尼古丁處理36 h的VSMC中α-肌動蛋白和平滑肌22α的mRNA水平降低約50%，而合成型VSMC標志物骨橋蛋白的合成上調1.5倍[31]。另外在一項相關研究中發現尼古丁處理可將VSCM膠原蛋白的表達提高2.1倍，而膠原蛋白I是VSMC合成表型的功能標記[32]。在一般情況下，細胞骨架蛋白數量是穩定的，肌球蛋白和肌動蛋白表達數量的變化說明VSMC的表型已從收縮型轉變為尼古丁暴露后的合成型。

Wang等人研究還發現尼古丁降低了VSMC自噬標志蛋白微管相關蛋白1輕鏈3-α與微管相關蛋白1輕鏈3-β的比值，提高了P65蛋白的表達與GFP-LC3 puncta的形成，且這種變化是通過尼古丁/nAChRs/ROS/NF-κB通路實現，由此可見尼古丁與VSMC的凋亡密切相關[29]。進一步研究發現，3-甲基腺嘌呤（3-MA，一種可有效阻止自噬的PI3K抑制劑）處理可消除尼古丁誘導的VSMCα-肌動蛋白、平滑肌22α和骨橋蛋白以及膠原蛋白I合成的增加，并抑制細胞遷移，由此可見VSMC凋亡在尼古丁誘導的VSMC表型轉化中起到了介導作用[31]。

2.2.2 VSMC遷移與增殖

尼古丁除了可以促進VSMC表型轉化，還可以引起VSMC遷移與增殖。Zhu等人發現經尼古丁處理的巨噬細胞胞漿miR-21-3p可被包裝成外泌體轉移到VSMC中，以劑量依賴性的方式抑制PTEN基因的表達，而實驗結果發現PTEN基因抑制有助于VSMC的遷移和擴散[33]。同時劃痕實驗與遷移實驗也表明尼古丁處理顯著提高了VSMC的遷移能力[6]。

Xu 等人研究揭示了尼古丁可以通過nAChRα1/STAT3/蛋白激酶 B（Protein Kinase B，PKB）/雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Target of Rapamycin，mTOR）信號通路促進小鼠VSMC的遷移和增殖。尼古丁能夠直接作用于VSMC上的nAChRα1，增加VSMC細胞STAT3磷酸化及增強STAT3的核易位，引起更多的p-STAT3與PKB啟動子區域的結合，上調MMP-1的表達[34]。MMP-1通過降解斑塊內膠原蛋白促進斑塊擴張、破裂和出血，為動脈粥樣硬化提供了條件[38]。因此，靶向nAChRα1/STAT3可能被認為是減輕尼古丁引起的動脈粥樣硬化病變的新治療策略。另外Ren等人在體外細胞研究中發現尼古丁對小鼠血管平滑肌細胞的作用也可由α1-nAChR誘導的鈣蛋白酶-1（Calpain-1）/MMP-2 / MMP-9信號通路介導[35]。MMP-2和MMP-9可通過細胞基質降解和細胞基質相互作用的消除來促進斑塊破裂并誘導血管平滑肌細胞凋亡[36]。

2.3 尼古丁與巨噬細胞的轉化與遷移

巨噬細胞是動脈粥樣硬化病變中最豐富的免疫細胞類型，在疾病的所有階段（從病變開始到斑塊破裂）都具有重要作用。在動脈粥樣硬化病變中，巨噬細胞積極參與脂蛋白的攝入和積累，從而形成充滿脂滴的泡沫細胞。逐漸積聚的泡沫細胞通過凋亡在內膜中死亡，如果不及時處置，其會壞死并逐漸形成壞死和導致血栓形成[37]。另外巨噬細胞可通過分泌細胞因子進一步加劇了病變發炎，其蛋白水解活性促進了斑塊的失穩和破裂，從而導致動脈粥樣硬化和相關的缺血事件，例如心肌梗塞或中風[38]。巨噬細胞在動脈粥樣硬化的發病機理中發揮的關鍵作用使它們成為治療心血管疾病發展的重要靶標。

Ming-Sheng等人研究發現，尼古丁可以增加人外周血CD36+/CD14+單核細胞的比例，且通過激活nAchR/ROS /蛋白激酶C（Protein Kinase C，PKC）/過氧化物酶體增殖物激活受體γ（Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）信號通路增加了人單核-巨噬細胞CD36的表達[39]。CD36是一種跨膜糖蛋白受體，可結合并內化動脈壁中的ox-LDL，促進巨噬細胞轉化為泡沫細胞，在動脈粥樣硬化病變的發生中起關鍵作用[40]。

在一項體外研究中，Ren等人發現尼古丁對小鼠巨噬細胞的作用可由α1nAChR誘導的calpain-1/MMP-2 / MMP-9信號通路介導，并對巨噬細胞的增殖和遷徙起促進作用[41]。過往研究認為，MMPs通過降解細胞外基質促進VSMC向動脈粥樣硬化區域遷移，并在該處增殖并增加病變的大小。此外由于在易損動脈粥樣硬化斑塊中檢測到MMPs水平升高，因此認為MMPs可能會降低纖維帽的強度并導致斑塊破裂[42]。另外也有研究表明，nAChRα1 負責調節尼古丁誘導的巨噬細胞p-STAT3，p-Akt和p-mTOR活化，而巨噬細胞經mTOR特異性抑制劑雷帕霉素處理后MMP-2表達明顯下降，揭示了尼古丁通過nAChRα1/STAT3/Akt/mTOR/MMP-2信號通路加速動脈粥樣硬化的可能性[43]。除了α1nAChR，近年來研究發現α7nAChR同樣是尼古丁作用于巨噬細胞的重要受體。Liu等人發現尼古丁通過激活巨噬細胞中的ERK1/2/c-Jun途徑誘導MMP-9，MMP-2，MCP-1和RANTES 上調， 且經α7nAChR 激動劑PNU-282987處理后上述信號轉導及因子的表達收到抑制[44]。在一個類似的實驗中，Li等人發現尼古丁促進了巨噬細胞MMP-2、MMP-9 和VCAM-1 的表達， 且經α7nAChR 激動劑PNU-282987處理后顯著抑制了巨噬細胞ERK1/2和c-Jun的磷酸化[45]。兩個實驗皆表明尼古丁對巨噬細胞的作用可能是通過α7nAChR/ERK1/2/AP-1（c-Jun）通路實現對下游因子表達的控制，未來對此類信號通路的進一步闡明將可能為動脈粥樣硬化提供新治療策略的新型分子靶標。

3 結語

尼古丁作為煙草的主要成分，在內皮細胞、巨噬細胞、血管平滑肌細胞的多條相關通路中扮演著重要角色，對動脈粥樣硬化的形成起著至關重要的作用。

尼古丁還涉及其他重要細胞，例如最近研究發現尼古丁會抑制與樹突狀細胞成熟和T細胞遷移相關的信號分子的表達[46]。對尼古丁致動脈粥樣硬化機制的深入探究有利于尋找心血管疾病的藥物治療靶點及藥物療效評估標準，為心血管藥物的開發提供新思路。