轉化醫學視角下頭頸癌人源性腫瘤異種移植瘤模型隊列的研究愿景

張志愿 孫樹洋

上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院口腔頜面-頭頸腫瘤科，上海交通大學口腔醫學院，國家口腔醫學中心，國家口腔疾病臨床醫學研究中心，上海市口腔醫學重點實驗室，上海200011

頭頸癌是全球第七大惡性腫瘤，局部晚期或復發轉移性頭頸癌患者占比超過60%，其頜面部病變顯著影響患者咀嚼、吞咽等功能和生存質量。近20 年來隨著顯微外科技術、分子靶向治療和免疫治療的創新發展，臨床中晚期的頭頸癌患者生存率有了長足的進步，但仍有相當部分患者出現復發、轉移，乃至死亡。現存多種治療策略無法滿足大部分患者的臨床獲益需求。如何深入理解頭頸癌的遺傳特征和發生發展機制，為臨床患者尋求精準醫學時代下的個體化治療策略，是當前廣大臨床醫生和科研人員亟待解決的難題。

1 頭頸癌輔助治療策略面臨多重困境

由于頭頸部解剖結構的復雜性和特殊性，晚期頭頸癌往往廣泛侵犯顱底、頸動脈等重要解剖結構。雖然外科術式的發展已經顯著改善大量晚期頭頸癌患者的臨床預后，但是頭頸癌輔助策略仍然進展緩慢，缺乏新療法的范式轉變。多項關于頭頸癌的臨床研究提示了頭頸癌輔助治療策略匱乏，缺乏有效生物標志物的現狀：西妥昔單抗是目前美國國立綜合癌癥網絡（national comprehensive cancer network，NCCN） 指南中頭頸癌一線治療靶向藥物，但在復發或轉移的頭頸鱗癌中，西妥昔單抗單藥治療應答率僅為13%；西妥昔單抗聯合同步放化療治療晚期頭頸鱗癌的研究提示該方案無法為患者帶來生存獲益，且表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）表達與藥效沒有相關性[1-2]；基于KEYNOTE-048的臨床研究結果，帕博利珠單抗單藥治療或帕博利珠單抗、鉑類和5-氟尿嘧啶聯合療法已納入復發/轉移頭頸癌一線治療方案，但是帕博利珠單抗單藥或聯合用藥可能會出現腫瘤超進展，整體中位生存期提升仍然相對較小[3]。

一項整合了28個國外臨床試驗（合計4 189例頭頸鱗癌患者） 的Meta分析結果提示，多西他賽、順鉑和5-氟尿嘧啶（TPF） 誘導化療方案無法為口腔鱗癌患者帶來生存獲益[4]。為了研究該結論是否同樣適用于中國人群，筆者研究團隊在科技部“十一五” 支撐計劃的支持下于2010年完成了全國首個口腔鱗癌誘導化療Ⅲ期臨床試驗[5]。研究結果表明，TPF誘導化療同樣不能提高局部口腔鱗癌的生存率，但發現了部分預測TPF 誘導化療療效的潛在標志物，如CCND1、GDF15 和ANXA1。雖然該研究已取得了一些成果，但是仍然存在著納入樣本量不足、且是單中心研究的局限性。為了克服上述問題，筆者研究團隊正在開展國家口腔疾病臨床研究多中心項目局部晚期口腔鱗癌臨床試驗，以進一步明確TPF誘導化療在局部晚期可切除口腔鱗癌中的作用，并且挖掘潛在的生物標志物。

臨床試驗能夠直觀展現頭頸癌患者的治療響應，同時也顯露出其治療局限性。聯合用藥已成為頭頸癌治療中常見治療策略，難以實現在臨床試驗中評估單藥臨床療效。此外，不同解剖部位的頭頸腫瘤從基因到表型上差異顯著，借助臨床試驗無法從分子層面深入挖掘腫瘤間和腫瘤內遺傳多樣性，尤其是治療中出現腫瘤耐藥或超進展時，僅依靠臨床試驗難以闡明驅動腫瘤進展的內在機制。因此，腫瘤治療急需理想的臨床前模型模擬人類腫瘤的遺傳學和生物學特征，以期揭開腫瘤發展和耐藥的神秘面紗，探尋有效的個體化治療策略。

2 PDX模型作為理想的臨床前研究工具

臨床前腫瘤模型包括人源性腫瘤異種移植瘤（patient-derived xenografts，PDX） 模型、人源性腫瘤來源細胞系（patient-derived cell lines，PDC）模型和人源性腫瘤來源類器官（patient-derived organoids，PDO） 模型。其中，PDX 模型是將患者腫瘤組織接種至免疫缺陷小鼠，使得患者腫瘤組織繼續在免疫缺陷小鼠上生長，通過序列傳代構建遺傳信息和組織學特征明確的移植瘤模型，是公認的理想的臨床前藥物篩選工具[6]。

早在20 世紀60 年代Pygaard 和Povlsen 將原發性結腸腺癌接種至裸鼠皮下，成功構建了世界上首例異種移植瘤模型[7]。70 年代中晚期，PDX 模型受到多次傳代丟失原發腫瘤特性的質疑[8-10]，但是，通過對比異種移植瘤模型和臨床患者對相同化療方案的響應差異，發現二者呈現高度相似性[11-13]。70 年代至90 年代，由于體外人類腫瘤細胞系的成功建立，逐漸興起了基于體外培養的腫瘤細胞系的異種移植（cell line-derived xenografts，CDX） 模型，這種培養模式簡單易行，腫瘤生長速率穩定[14-15]。但是，隨后研究發現細胞系和CDX模型在生長過程中已經適應體外培養環境，造成了不可逆的生物學特性改變，顯著丟失了腫瘤關鍵遺傳特征和腫瘤異質性[16-18]。由于上述局限性，PDX 模型在21 世紀初得以復興并廣泛應用于癌癥臨床前研究[19-22]。

PDX 模型含有患者來源的多種腫瘤相關細胞和細胞外基質的細胞群體，并保存了腫瘤進展過程中腫瘤細胞與微環境交流的信息。在傳代早期，PDX 模型可以較好地保持人源性的基質成分和免疫相關細胞，隨著傳代次數增長，鼠源性的基質逐步替代腫瘤中的人源性基質[23]。因此，在構建PDX 模型的過程中至關重要的一點就是PDX 模型的穩定性評估，只有通過生物信息學分析PDX 模型的突變狀態、拷貝數改變、基因表達和組織形態與患者腫瘤具有高度一致性，PDX 模型才算成功構建。值得注意的是，不同惡性程度的腫瘤在構建PDX 模型時具有不同的轉歸。成功建模的肺腺癌PDX 模型中與細胞增殖相關的基因上調并伴隨EGFR的突變，這一情況與腫瘤的較差的預后相關[24]。相較于原發腫瘤，復發或轉移的腫瘤組織更易于構建PDX 模型，筆者研究團隊在構建頭頸癌PDX模型過程中也得出類似結論[25-26]。此外，傳代過程中PDX 模型腫瘤細胞豐度不斷增加，經過純化后的腫瘤細胞比原代腫瘤具有更高的PDC 模型構建成功率。近幾年，筆者團隊的孫樹洋研究員已經完成涵蓋患者來源的PDX 模型、PDC 模型及免疫系統人源性化PDX 模型等千余例個體化模型的建立和遺傳學鑒定，搭建了全球最具規模的頭頸部腫瘤藥物個性化評估平臺。

3 PDX模型精準反映腫瘤特征和克隆進化

腫瘤可被視為多種異質性克隆亞簇的集合，而攜帶不同遺傳和表觀遺傳變異的克隆亞簇是耐藥發生的重要因素[27]。由于基因組不穩定性和腫瘤微環境的選擇壓力，腫瘤內異質性的克隆亞簇存在時間和空間上的動態演進，促使優勢克隆亞簇群體富集。PDX 模型可在數次傳代擴增中穩定保持患者腫瘤的遺傳特征和克隆進化過程。如頭頸鱗癌中TP53、NOTCH1 等抑癌基因高頻突變，通過檢測頭頸鱗癌PDX 模型和臨床患者的基因表達譜發現二者具有高度一致性[28]。在其他腫瘤如乳腺癌、結直腸癌及其PDX 模型中也得出類似結論[29-30]。對乳腺癌原發腫瘤、腦轉移灶和原發腫瘤來源的PDX 模型進行基因組測序分析發現，原發腫瘤來源的PDX 模型在保留原發腫瘤的基因突變基礎上同時也富集了腦轉移灶的基因突變，這也表明PDX 模型具有模擬腫瘤轉移時克隆亞簇改變的能力[31]。

盡管Ben-David 等[32]曾提出小鼠特異性選擇壓力導致PDX 模型存在有別于原發腫瘤的克隆進化方向，這引發了PDX 模式是否能夠作為有效的臨床前驗證模型的擔憂。但是，隨后1 451例PDX模型和509例患者腫瘤的拷貝數變異分析結果很快解除了該質疑：Woo 等[33]發現傳代過程中PDX 模型會產生少量隨機突變，但是其并未涉及腫瘤相關驅動突變，PDX 模型仍然能夠穩定且真實地體現臨床患者的遺傳學信息，并呈現高度相似的腫瘤進化改變。此外，目前已明確人類乳頭狀瘤病毒（human papillomavirus，HPV） 感染不僅驅動超過90% 的宮頸癌發病，同時也與口咽癌的發生具有高度相關性。對于HPV 陽性口咽癌，PDX 模型能夠有效保留病毒活性和轉錄表達，為深入探究病毒感染影響口咽癌發生發展機制和治療響應差異提供理想的體內研究模型[28,34]。

4 PDX模型助力挖掘腫瘤個性化治療策略

4.1 評估藥物敏感性差異

在抗癌藥物研發的過程中，約90% 臨床前模型中具有活性的藥物進入臨床試驗后未表現出相應的有效性，究其原因是缺乏真實反映腫瘤遺傳學多樣性和腫瘤— 藥物互作的臨床前模型[35]。PDX 模型可作為反饋藥物敏感性的臨床前篩選平臺，有效助力新藥研發和 “老藥新用”。多個PDX模型組成充分涵蓋腫瘤間和腫瘤內異質性的治療隊列，能夠復制患者的基因組和生物學行為映射至PDX 模型，能夠從群體層面呈現臨床患者治療敏感性差異。此外，根據實驗需求，PDX 模型可在不同時間節點多階段取材，結合生物信息注解下的組學數據，有效挖掘藥物敏感性生物標志物，并揭示潛在的藥物敏感及耐藥機制。諸多實驗證實PDX 模型和PDX 來源的PDC 模型能夠有效模擬群體水平臨床患者的藥物治療響應：Hallin 等[36]使用KRASG12C抑制劑MRTX849 篩選KRASG12CPDX模型和細胞系中的藥物敏感性差異， 并揭示MRTX849作用下不同時間節點敏感PDX 模型的轉錄表達富集通路；Bruna 等[37]構建了83 例乳腺癌PDX模型，對其中22例PDX來源的PDC模型進行高通量藥物篩選，并進一步在PDX 模型隊列中驗證其中40種化合物的體內藥效響應。

考慮到臨床研究往往基于聯合用藥策略進行設計，PDX 模型還具有評估個體間單藥治療藥效差異的獨特優勢。2015 年，諾華生物醫學研究所納入了約1 000 例PDX 模型開展高通量藥物篩選，首次提出了 “1×1×1” 理論，即1個患者1只小鼠1種藥物開展臨床替代性試驗[20]。該研究揭示了多種全新藥物治療策略，如BRAF抑制劑康奈菲尼與CDK4/6 抑制劑LEE011 聯用較單藥治療顯著延長小鼠的無進展生存期，并延緩耐藥發生。筆者課題組也借助 “1×1×1” PDX模型開展了多項臨床替代性試驗：孫樹洋研究員在CDK4擴增的黏膜惡性黑色素瘤PDX 隊列開展藥敏試驗，使用mRECIST標準評估藥效響應，揭示CDK4擴增可作為預測帕博西尼（Palbociclib） 藥物敏感性的生物標志物；此外，利用黏膜惡性黑色素瘤PDX 隊列，筆者課題組發現帕納替尼（Ponatinib） 較伊馬替尼（Imatinib） 對酪氨酸激酶受體c-kit V560D、K642E 和D816V 突變黏膜惡性黑色素瘤患者具有更高敏感性[38-39]。

4.2 推進開展同期臨床試驗

基于頭頸癌缺乏分子分型指導的靶向治療現狀，開展PDX 模型進行同期臨床試驗，將助力頭頸癌的轉化醫學研究。根據患者遺傳學特征及靶向藥物預測性標志物分型標準，在PDX 模型樣本庫中進行模型匹配和對應，進而在PDX 模型中開展與臨床試驗治療一致的PDX 模型同期臨床試驗[6]。同期臨床試驗的原則是，對于原發耐藥模型，將其對應患者剔除，而對于藥物敏感的PDX模型則持續治療，當PDX 模型出現繼發耐藥，分析鑒定耐藥機制并制定和評估聯合用藥方案。由于PDX 小鼠體內的腫瘤生長周期更短，當PDX 模型對應臨床患者出現耐藥，通過耐藥組織活檢樣本與PDX 耐藥模型匹配，根據模型藥效評估結果輔助臨床聯合用藥方案的制定。該實驗方案可以短時間內獲得遺傳學特征明確的 “患者”，開展小鼠的臨床Ⅱ期試驗，為后續臨床患者的聯合用藥策略提供有效參考。同時，也為頭頸癌以外其他腫瘤提供理想的替代模型。

4.3 發展人源性PDX模型

PDX 模型小鼠在多次傳代后會逐漸喪失人源性免疫細胞，因此無法深入研究免疫微環境在腫瘤進展中所發揮的作用。隨著腫瘤免疫治療的不斷發展，建立人異種移植腫瘤且具有人源化免疫系統的動物模型可以在動物體內盡可能真實地反映腫瘤和免疫系統的相互作用，并可以應用于腫瘤免疫藥物的篩選及其抗腫瘤機制的研究。在動物體內建立人源性PDX 模型比較常見的方式主要分為人造血干細胞移植腫瘤模型和人源性化外周血單核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC） 小鼠模型，其中，人源性化PBMC小鼠腫瘤模型是現階段較為成熟的一種技術。多個實驗室通過將健康成人外周血單核細胞注射至免疫缺陷的小鼠體內繼續增殖和分化，從而在小鼠體內重建人的以T細胞為主的人源免疫細胞。利用這一類動物模型建立的PDX 腫瘤模型既具有人源性腫瘤的特征，又獲得了人源性免疫細胞的相關特征，可進行T細胞免疫調節相關靶點抗體類藥物和腫瘤疫苗等腫瘤免疫治療藥物的臨床前研究[40]。

考慮到通過PBMC 建立的人源性PDX 涉及了人免疫系統在小鼠體內的功能重建過程，還涉及了異體/異種排斥反應、移植物抗宿主反應等諸多問題。目前也進行了許多進一步的人源性小鼠腫瘤模型的嘗試，如通過將人源CD34+造血干細胞移植到免疫缺陷小鼠體內，在小鼠體內分化出免疫細胞，獲得人免疫系統重建的小鼠，進而建立人源性造血干細胞小鼠腫瘤模型[41-42]。通過此種方式建立的人源免疫細胞在動物體內發育和成熟，可以較為有效地避免移植物抗宿主反應，便于開展長期研究。筆者所在的研究團隊已成功建立了基于PBMC 的頭頸部惡性腫瘤PDX 人源性模型，并開展了部分腫瘤免疫藥物的篩選工作。

5 結語及展望

隨著多組學和生物信息分析技術的進步，腫瘤研究闊步邁向個體化醫療時代。PDX 模型在覆蓋患者間和患者內腫瘤異質性的基礎上，為實現以精準醫學為核心的個性化治療方案提供臨床前模型參考。這種為患者 “量身定做” 的模型盡可能復制腫瘤的特征，能夠從分子層面重新認識腫瘤的本質和發生發展機制，為在臨床前評估藥效，發現腫瘤生物標志物和耐藥機制，進一步研究藥物聯用策略提供了有效的研究平臺。由于PDX 模型不可避免地喪失了患者腫瘤細胞與免疫細胞之間的互相作用，除重建人源化PDX 模型之外，原代腫瘤還可以通過構建PDO 模型在體外重塑腫瘤微環境。PDO 模型所需時間相對較短，且基質膠包裹腫瘤細胞可提供模擬體內生存狀態的三維培養環境，為探究免疫相關腫瘤研究提供了另一理想模型。此外，包括EurOPDX 在內的諸多PDX 模型庫中，HPV 相關頭頸癌等病毒性模型數量仍然相對較少。未來，立足于豐富的樣本資源，擴大該類極具特色的頭頸腫瘤PDX 模型建立，同時進一步促進各個PDX 模型庫共同合作，納入大規模人群隊列開展無偏移的臨床前研究需要所有科研人員的共同努力。

利益沖突聲明：作者聲明本文無利益沖突。