表觀遺傳學在巨噬細胞骨免疫調節中的研究進展

劉旭琳，廖 娟

(1.西南醫科大學，四川 瀘州 646000；2.四川省醫學科學院·四川省人民醫院口腔科，四川 成都 610072)

表觀遺傳是指基因序列不變，而基因表達發生可以遺傳的改變。最新研究表明，多種表觀遺傳修飾影響巨噬細胞極化狀態，從而實現骨免疫調控，但對于其詳細機制還有待深入研究。本文針對表觀遺傳修飾在巨噬細胞骨免疫調控中的作用及其在牙周骨組織再生方面的研究進展予以綜述。

1 表觀遺傳學

表觀遺傳學定義為在無DNA序列的改變的前提下，發生蛋白質表達的變化，并可以在細胞增殖和機體發育過程中穩定地傳遞，與多種病理生理過程具有密切聯系[1]。表觀遺傳學是在研究與傳統的遺傳學不相符的許多生命現象過程中逐步發展起來的一門前沿學科，其調控方式主要包括：DNA甲基化、組蛋白乙酰化或甲基化、非編碼RNA(ncRNAs)修飾等，各調控方式單獨作用或相互影響。

2 巨噬細胞

2.1 巨噬細胞的不同極化狀態及其生理作用巨噬細胞作為一種異質性固有免疫細胞，具有高度的可塑性，在一些關鍵轉錄因子及信號通路的作用下，可轉變為促炎破骨M1型或抗炎成骨M2型以進行骨免疫調節，近年來在骨組織再生及組織工程領域受到了廣泛關注。近年的新理論認為，巨噬細胞的極化及機體穩態條件下的骨組織改建都是通過轉錄因子、細胞因子、多種信號通路和表觀遺傳調節等多層系統交織而成的復雜網絡共同調控的，其中表觀遺傳是重要的調控環節[2]。

2.2 巨噬細胞的骨免疫調節機制有學者指出，免疫系統和骨系統間存在著密不可分，其互相調控的交互機制被稱為骨免疫。巨噬細胞的骨免疫調控受到多種調控系統的影響，如核因子κB受體活化因子(receptor activator of nuclear factor-κB，RANK)/核因子κB受體活化因子配體(receptor Activator of Nuclear Factor-κB ligand，RANKL)/骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)系統、WNT/β-連環蛋白信號通路。巨噬細胞分泌的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)、骨刺激因子等可調控成骨。

3 表觀遺傳修飾對巨噬細胞骨免疫的調控

3.1 DNA甲基化DNA甲基化是一種穩定的表觀遺傳修飾，是指胞嘧啶C-5位上增加或移除一個甲基。DNA甲基化對巨噬細胞的表觀遺傳學調控的研究還較少，目前僅DNMT3b、DNMT1已被證實參與到了巨噬細胞極化進程中。Yang等[3]研究表明肥胖小鼠DNMT3b異常表達，導致巨噬細胞向M2極化受限，從而導致慢性炎癥，而DNMT3b敲除后呈現相反趨勢。Cheng等[4]研究發現DNMT1引起細胞因子信號轉導抑制蛋白1啟動子甲基化水平升高，使其表達被抑制，促進巨噬細胞釋放LPS誘導的促炎細胞因子，如TNF-α和IL-6的釋放，以誘導其促炎表型。

3.2 組蛋白乙酰化染色質中的核小體重要組成成分組蛋白，可以被乙?；蚣谆?。值得關注的是，組蛋白乙酰轉移酶(histone deacetylase，HDAC)對巨噬細胞表型的影響作用不同。DOU等[5]證明HDAC2是RANKL誘導破骨細胞形成的關鍵陽性調節因子：在破骨細胞形成過程中，骨髓巨噬細胞HDAC2表達升高，而通過慢病毒感染缺失HDAC2，則抑制骨吸收。相反地，HDAC7及HDAC9被證明抑制炎癥性骨吸收。Stemig 等[6]證明小鼠破骨細胞中有條件的HDAC7的缺失可抑制轉錄因子MITF的活性，導致破骨細胞形成在體內增強，并與骨吸收增加相關，但該研究并未涉及其骨吸收的表觀遺傳學調控是否與巨噬細胞免疫調控有關。Li等[7]研究發現在慢性炎癥條件下，HDAC9是牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)中受影響最嚴重的HDAC家族成員，miR-17通過抑制HDAC9誘導炎癥環境下PDLSCs的成骨分化。由此看來，干預調控HDAC的表達有望成為通過巨噬細胞進行骨免疫調節的表觀遺傳學手段。

3.3 NcRNA隨著基因組及轉錄組研究進展，曾被認為進化過程中累積的“垃圾序列”的ncRNAs，被越來越多的研究證實參與了基因調控。雖然ncRNA調節各種生物過程和人類疾病的機制仍然大部分未知，但是到目前為止人們已發現不少ncRNA，尤其是微小RNA(miRNAs)參與巨噬細胞極化調控[8]。Graff等[9]發現，巨噬細胞在受到LPS、IL-4等外界刺激時，miRNAs表達量會發生明顯改變，相應的，過表達或抑制部分miRNAs后，也會調控巨噬細胞極化進程。目前已確認的促進M1型巨噬細胞極化的miRNA有miR155、let-7c、miR-125a-5p，促進M2型巨噬細胞極化的miRNAs有miR-223、miR-124、miR-146[9]。另外，一些miRNA被證實與炎癥刺激下骨吸收相關，例如炎癥刺激下破骨分化中表達上調的有miRNA-21、miRNA-31、miRNA-182、miRNA-148、miRNA-31、miRNA-378等，表達下調的有：miRNA-34a，miRNA-155、miRNA-150、miRNA-146a、miRNA-141、miRNA-34a、miRNA-223等[10～12]。長鏈非編碼RNA(long noncoding rna，lncRNAs)在自身免疫性疾病及腫瘤領域的研究較多，其在免疫細胞發育、分化和活化的過程中廣泛表達，既可以作為轉錄調節因子，也可以通過影響其它因子來調節免疫基因的表達，參與免疫調節[13]。目前已有LncRNA通過巨噬細胞對類風濕性關節炎免疫調控的研究，但尚缺乏其對巨噬細胞骨免疫調控的研究報道。

3.4 外泌體近年最新研究中，一種叫外泌體的脂質包裹體結構備受關注。外泌體是一種直徑為30～100 nm，內部包裹蛋白、脂質以及miRNA、circRNA、lncRNA等遺傳信息的膜性囊泡[14]。通過外泌體運輸，細胞可將生物信息長距離傳遞至受體細胞并影響受體細胞功能，實現細胞間通信，但目前，在骨髓微環境中何種細胞可分泌攜帶成骨信號的外泌體，外泌體又如何實現不同細胞間的相互調控，仍需深入研究。骨髓基質干細胞(Bone marrow stromal cells，BMSCs)可通過外泌體將表觀遺傳信息轉運至相應受體細胞。Liu 等[15]研究發現BMSCs來源的外泌體與破骨前體細胞—小鼠單核巨噬細胞白血病細胞Raw264.7混合，外泌體可隨時間推移逐漸進入Raw264.7中，并促進Raw264.7分化為破骨細胞，證實BMSCs可通過外泌體促進破骨細胞的分化成熟。巨噬細胞吞噬人頜骨BMSCs來源的外泌體后，miR-223、miR-let-7c含量升高，促進巨噬細胞向M2型極化，減弱骨的炎性吸收，提高新骨形成[17]。

4 表觀遺傳學調控巨噬細胞免疫成骨在牙周骨組織再生方面的研究

4.1 口腔種植鈦(Ti)及其合金是目前應用廣泛的牙科植入材料。然而，種植體作為一種異物，植入后的修復過程也被視為機體對種植體的免疫反應過程，過度的宿主免疫反應常不利于早期種植體骨結合，從而影響種植成功率及長期穩定性。而巨噬細胞作為炎癥早期固有免疫細胞，與種植體周圍疾病息息相關。研究表明，當發生種植體周圍疾病時，種植體周圍黏膜中的巨噬細胞比例增大、功能活躍、表型易發生重編程，巨噬細胞極化同時也受種植體周圍病原菌的影響，不同表型的巨噬細胞可引導種植體周圍疾病向不同方向發展[16]。近年來，眾多研究致力于鈦種植體的表面修飾，試圖通過種植體表面改性以調控巨噬細胞介導的骨免疫來實現更好的種植體周圍骨結合。Lu等[17]研究發現Sr可以調節巨噬細胞的免疫反應，抑制IL-6的表達和產生骨形態發生蛋-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP2)，促進成骨。Zhao等[18]利用磷酸化學轉化技術在鈦植入物表面制備了鈣-鍶-鋅-磷酸鹽(calcium-strontium-zinc-phosphate，CSZP)涂層，該表面形貌和元素的修飾通過傳遞IL-4，在體內外均能誘導CSZP上的巨噬細胞M2極化，促進BMSCs成骨。然而，以上這些研究尚未將種植體表面材料對巨噬細胞骨免疫調控的影響與表觀遺傳學聯系起來。

目前為止，巨噬細胞調控的種植體周圍骨結合及種植體周圍疾病的表觀遺傳機制研究得很少，且僅限于DNA甲基化和miRNAs，其證據僅來自少數臨床前研究。例如，Daubert等[19]研究發現，從種植體周圍齦溝液取樣，測得種植體周圍炎的樣本中，整體DNA甲基化水平較正常組升高。因為種植體周圍齦溝液中主要存在巨噬細胞及其炎性因子和上皮細胞及其分泌物，而巨噬細胞和上皮細胞內外都檢測到有溶解的鈦顆粒，故可能由于溶解的鈦顆粒的存在，改變了巨噬細胞和上皮細胞的生存環境，從而改變了其DNA甲基化水平，導致其表型的改變。另外，有研究發現，種植體表面的鈦顆粒脫落促使巨噬細胞向M1型極化不利于種植體周圍骨愈合[20]。表觀遺傳可受環境影響而發生改變，而種植體表面材料為巨噬細胞提供的特殊環境將如何影響巨噬細胞的表觀遺傳狀態，導致其表型發生怎樣的改變，進而導致其對骨免疫調控發生怎樣的影響仍需要更深入的探索。這也為種植體周圍炎的研究提供了新的病因學思路和治療靶點。

4.2 牙周炎過往研究認為來自牙周致病菌的內毒素、外毒素和酶是造成牙周炎患者牙周組織發生溶解、吸收的主要原因。然而隨著研究的進一步深入，學者們發現單純的菌群紊亂不足以引發嚴重的骨吸收。牙周致病菌感染后可引發宿主的固有免疫和適應性免疫應答，參與這一過程的免疫細胞、炎癥因子及抗體等，才是造成牙周組織破壞的主要因素[21]。

近年來，相關的表觀遺傳學研究逐漸增多，DNA甲基化、組蛋白乙?；皀cRNA相關研究均有報道。Jiang等[22]研究發現DNA甲基化狀態的改變可能導致牙周炎進程中某些基因選擇性地激活或沉默，進而導致細胞因子、趨化因子、信號分子、細胞外基質分子等蛋白質表達水平的改變，使局部微環境發生變化，從而影響包括巨噬細胞在內的免疫細胞的激活狀態。另外，Cantle等[23]推測牙齦組織炎癥誘導的巨噬細胞極化可能是加劇牙周組織破壞的原因，他們發現牙周炎患者的牙齦組織中HDAC 1、5、8、9的RNA表達水平上調。除此之外，有研究表明牙周炎中miR-128的升高通過巨噬細胞中P38信號通路減輕TNF-α的反應，通過促分裂原活化蛋白激酶的調控以調節內毒素耐受[24]。表觀遺傳藥物在炎癥受損的骨愈合中治療用途的研究也有見報道，例如Chen等[25]發現n-甲基吡咯烷酮和n，n-二甲基乙酰胺可以保護BMSCs在成骨過程中免受TNF-α的不利影響。但該研究是以BMSCs為治療靶點，目前尚未見以巨噬細胞為表觀遺傳學治療靶點的藥物研究報道。

4.3 口腔正畸正畸牙移動的過程中，正畸力可誘導與炎癥單核細胞相關的系統免疫反應，使全身性炎癥單核細胞在正畸力刺激下被招募到牙周組織中，從而實現壓力側的骨吸收和張力側的骨再生，進而使牙齒移動到一個新的牙周位置[26]。在炎癥微環境中，PDLSCs會不可逆地失去成骨潛能，這與炎癥環境中炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α增高，經典Wnt通路和NF- κB通路高度活化有關。He等[27]研究發現正畸牙移動過程中，受力后的PDLSCs炎癥因子表達增加，增殖能力增加，同時可促進M1型巨噬細胞的極化和趨化，此外M1與M2型巨噬細胞的比率可以影響正畸牙齒的移動以及正畸牙齒移動過程中的牙根吸收。近年來研究發現，在培養的PDLSCs中，miRNAs可能是機械敏感的，并在骨重建過程中作為關鍵的轉錄后調節因子出現[28]。Wei等[29]總結出在機械牽張力作用下的PDLSCs中被報道上調的miRNA有53種。其中miR-21及其功能靶標PDCD4參與了對細菌性病原體和LPS的先天免疫應答，且相關miRNA的表達對牙周組織中正畸力的響應呈劑量和時間依賴性[30]。另外，Alexander 等[31]發現，外源性樹突狀細胞的外泌體可轉運至 miR-146a 缺乏小鼠的免疫細胞中，抑制LPS刺激后的IL-6和 TNF-α釋放，減少炎性因子導致的骨吸收，這與樹突狀細胞的外泌體可在B細胞、T細胞及樹突狀細胞等免疫細胞中傳遞有關，巨噬細胞是否參與其中的免疫調控還有待研究。

5 小結與展望

綜上所述，巨噬細胞通過不同的極化狀態，在機體免疫系統參與骨穩態調節中發揮重要作用。表觀遺傳調控是機體各種生理病理過程中重要的基因表達調控方式，已經成為環境因素和基因轉錄調控之間的重要聯系。其機制復雜多樣，涉及的調節通路眾多，尚未形成明確的理論體系。因為表觀遺傳修飾在真核生物中普遍存在，利用其在細胞核內的骨免疫調控是一種極具潛力的骨組織修復再生療法。但由于表觀遺傳修飾種類紛繁復雜，機制尚不甚明了。DNA甲基化、組蛋白修飾及 ncRNAs 都可能通過單獨或者相互作用的方式，參與到巨噬細胞骨免疫調節的表觀遺傳調控中，從而影響成骨與破骨之間的平衡。如何利用表觀遺傳學機制進行牙周骨組織免疫調控是骨組織工程中的一大難題。在口腔臨床中涉及的問題主要包括：如何減少牙周炎造成的牙周組織喪失、有效促進種植體周圍骨整合、減少種植體周圍疾病的發生、控制正畸牙移動過程中的骨改建等。我們相信，今后隨著生物信息學相關技術的迅速發展，表觀遺傳修飾方式及調控機制的不斷揭示，將對骨免疫調節及骨組織工程起到巨大推動作用。