miR-92a與miR-19b對小鼠胰島β細胞胰島素基因表達的影響*

李旭艷，翟文君，付 娜，田 娟

（1嶺南師范學院生命科學與技術學院，廣東湛江 524000；2東北林業大學生命學院，黑龍江哈爾濱 150040）

糖尿病是一種典型的內分泌代謝疾病，已成為嚴重威脅人類健康的公共衛生問題。糖尿病可分為Ⅰ型、Ⅱ型、妊娠和特殊類型糖尿病，雖然分型不同，但其發病主要歸因于胰腺β 細胞數量減少或功能下降導致的胰島素分泌相對不足或胰島素抵抗。胰島素的表達、合成和分泌受轉錄因子、微小RNA（mi?croRNA，miRNA）、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、營養因子和激素等多種因素調控。轉錄因子胰十二指腸同源框蛋白1（pancreatic and duodenal homeobox protein 1，Pdx1）、肌腱膜纖維肉瘤癌基因同源物A（musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog A，Mafa）、神經源性分化因子1（neurogenic differentiation factor 1，NeuroD1）等可結合胰島素基因啟動子，激活其表達。胰腺內分泌轉錄因子Pdx1、Mafa、神經元素3（neurogenin 3，Ngn3）等的表達又受GLI 樣蛋白3（GLI-similar 3，GLIS3）、鳥嘌呤核苷酸結合蛋白Gsα 亞基短異形體（guanine nucleotide-binding protein Gssubunit alpha isoforms short，GNAS）等調控［1-2］。miRNAs和lncRNAs是一類不具有蛋白編碼潛能的非編碼RNA，在糖尿病和β細胞中發揮重要作用，如miR-26a［3］、miR-96［4］、miR-770［5］、miR-124a［6］、lncRNA ROIT［7］、環狀RNA（circu?lar RNA，circRNA）HIPK3［8］等。

miR-92a 和miR-19b 是miR-17-92 家族成員，參與調控神經和骨骼等多種組織器官發育和腫瘤細胞的發生、發展。近年來發現，miR-92a 和miR-19b 在胰腺癌、糖尿病及其并發癥患者血清中表達異常，可能參與胰腺疾病發生、發展過程［9-12］。本項工作以小鼠胰島素瘤細胞為研究對象，分別轉染陰性對照miRNA（negative control miRNA，NC）、miR-92a 和miR-19b，檢測胰島素基因表達情況，探究miR-92a和miR-19b 對小鼠胰島β 細胞胰島素基因表達的調控作用，將豐富胰島β細胞功能調控機制。

材料和方法

1 細胞

小鼠胰島素瘤MIN6 細胞、成體胰腺祖細胞（pancreatic progenitor cells）和小鼠成纖維細胞3T3為東北林業大學發育生物學實驗室提供［12］。

2 主要試劑

RPMI-1640 培養液、DMEM 培養液、DMEM/F12培養液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、新生牛血清（newborn calf serum，NCS）和B27 細胞培養添加劑購自Gibco；青-鏈霉素、L-谷氨酰胺和胰蛋白酶購自HyClone；重組人胰島素和表皮生長因子（epider?mal growth factor，EGF）購自Becton；細胞轉染脂質體Lipofectamine RNAiMAX 和Lipofectamine 2000 購自Invitrogen；總RNA 提取試劑TriPure 和實時熒光定量PCR 試劑購自Roche；E.coliPoly（A）聚合酶和ATP購自NEB；脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNaseI）和核糖核酸酶抑制劑（ribonuclease inhibi?tor，RRI）購自TaKaRa；反轉錄試劑盒、抗β-肌動蛋白（β-actin）抗體（HC201-02）、羊抗鼠和羊抗兔辣根過氧化物酶標記的II 抗（HS201-01 和HS101-01）購自北京全式金生物技術有限公司；Cell Counting Kit-8（CCK8）購自Dojindo Labratories；BCA 蛋白濃度測定試劑盒、RIPA 蛋白裂解液和Alexa Fluor 555 標記的驢抗兔熒光Ⅱ抗（A0453）購自碧云天生物技術研究所；抗胰島素抗體（sc-9168）購自Santa Cruz；抗NeuroD1 抗體（ab60704）購自Abcam；高純度質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega；β-巰基乙醇、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲基雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺購自Sigma；甲醇和吐溫20 等常規生化試劑購自天津天大化學試劑廠。含NeuroD1 3′UTR 的螢火蟲螢光素酶報告載體和海腎螢光素酶報告載體由東北林業大學發育生物學實驗室提供。NC、miR-92a 和miR-19b 由吉瑪基因股份有限公司合成，序列見表1。qPCR引物由金唯智基因公司合成，序列見表2。

3 主要方法

3.1 細胞培養 MIN6 細胞用含10% FBS、1% L-谷氨酰胺、1%青-鏈霉素和50 μmol/L β-巰基乙醇的RPMI-1640 完全培養液培養。胰腺祖細胞傳代后，用10%貼壁培養液過夜培養，次日早更換2%生長培養液。胰腺祖細胞貼壁培養液為含10%FBS、1%青-鏈霉素和1% L-谷氨酰胺的DMEM/F12 培養液。胰腺祖細胞生長培養液為含2% FBS、1%青-鏈霉素、1%L-谷氨酰胺、2%B27 細胞培養添加劑、50 μmol/L β-巰基乙醇、10 mg/L 重組人胰島素和20 μg/L EGF的DMEM/F12 培養液［13］。3T3 細胞用含有10%NCS、1% L-谷氨酰胺和1%青-鏈霉素的DMEM 高糖培養液培養。細胞放置在37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養，根據生長情況每2～3 d 換液，細胞生長至80%以上匯合時傳代。

3.2 細胞轉染 24 孔板每孔接種1×105個MIN6 細胞，根據轉染miRNAs 的不同，實驗分為NC 組、實驗I（miR-92a）組和實驗II（miR-19b）組。NC 組細胞轉染NC，實驗I 組細胞轉染miR-92a，實驗II 組細胞轉染miR-19b。細胞轉染參照Lipofectamine RNAiMAX說明書操作，每組均設3 個復孔。轉染48 h，倒置顯微鏡采集圖像。

表1 miRNAs序列Table 1.The sequences of the miRNAs

表2 qPCR引物序列Table 2.The sequences of the primers for qPCR

3.3 CCK8 法檢測細胞活力 96 孔板接種MIN6 細胞，生長至50%匯合，分別轉染50 nmol/L NC、miR-92a 和miR-19b 后48 h，PBS 洗滌細胞，37℃條件下，用含10% CCK8 的RPMI-1640 培養液孵育2 h，酶標儀讀取吸光度（A）。每組均設3個復孔。

3.4 qPCR 檢測各基因mRNA 的表達 胰腺祖細胞和MIN6 細胞復蘇傳代培養3 代后，消化、離心、收集細胞，TriPure 裂解細胞，提取總mRNA，消化基因組DNA。1 μg 總mRNA 加polyA 尾，反轉錄，檢測內源性miR-92a 和miR-19b 表達，以U6 為內參照，通過2?ΔΔCt方法計算相對表達量。實驗設置3個重復。

MIN6 細胞轉染50 nmol/L NC、miR-92a 或miR-19b 后48 h，TriPure 裂解細胞，提取總RNA，檢測無基因組污染，取1 μg總mRNA加polyA尾，反轉錄后，qPCR 驗證miR-92a 和miR-19b 過表達，以U6 為內參照。另取1 μg 總mRNA 通過隨機引物反轉錄，獲得cDNA，實時定量PCR 檢測Ins1 和Ins2 的mRNA 表達，以β-actin為內參照，通過2?ΔΔCt方法計算相對表達量。實驗設置3個重復。

3.5 Western blot 檢測蛋白的表達 MIN6 細胞轉染50 nmol/L NC、miR-92a 或miR-19b 后72 h，PBS 洗滌細胞，RIPA 裂解液裂解，離心取上清，測定蛋白濃度。樣品進行SDS-PAGE，轉膜，37℃封閉1 h，抗βactin（1∶1 000）、insulin（1∶300）和NeuroD1（1∶100）抗體4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，Ⅱ抗（1∶5 000）室溫孵育1 h，用Tanon 5200 發光成像系統采集圖像。以β-actin為內參照。

3.6 免疫熒光染色 MIN6細胞轉染50 nmol/L NC、miR-92a 或miR-19b 后72 h，PBS 洗2 次，4%多聚甲醛室溫固定30 min，PBS 洗3 次，0.3% Triton X-100室溫孵育30 min，PBS 洗3 次，10%馬血清37℃封閉1 h，抗insulin 抗體（兔源，1∶100）4℃孵育過夜，PBS洗3次，驢抗兔FITC 標記的Ⅱ抗（1∶200）室溫避光孵育1 h，PBS 洗3 次，DAPI（1∶2 000）室溫避光孵育5 min，PBS 洗3 次，封閉液封閉，熒光顯微鏡采集圖像。ImageJ軟件統計陽性染色細胞數量。

3.7 雙螢光素酶報告基因實驗 經質粒高純提取試劑盒提取含NeuroD1 3′UTR 的螢火蟲螢光素酶報告載體和海腎螢光素酶報告載體質粒，乙醇純化，與50 nmol/L NC、miR-92a 或miR-19b 共轉染3T3 細胞。細胞轉染參照Lipofectamine 2000說明書操作。轉染48 h 后，按照雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒說明書操作，裂解細胞，測定裂解液螢火蟲螢光素酶和海腎螢光素酶的活性，并計算比值。

4 統計學處理

用GraphPad Prism 7 軟件進行統計學處理。數據采用均數±標準誤（mean±SEM）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 MIN6 細胞中內源miR-92a 和miR-19b 的表達水平

復蘇胰腺祖細胞和MIN6 細胞，傳代培養3 代后用于實驗。光鏡下觀察到典型的上皮細胞樣形態，見圖1。

Figure 1.Light microscopic observation of the pancreatic progenitor cells and MIN6 cells.The scale bar=100 μm.圖1 胰腺祖細胞和MIN6細胞光鏡圖

提取細胞RNA，通過qPCR 檢測內源miR-92a 和miR-19b 表達。與胰腺祖細胞相比，MIN6 細胞中內源miR-92a和miR-19b表達水平顯著降低（P＜0.01），見圖2。這說明miR-92a和miR-19b在胰島細胞中低表達。

2 miR-92a和miR-19b在MIN6細胞的過表達

將NC、miR-92a 和miR-19b 分別轉染MIN6 細胞48 h后，提取RNA，通過qPCR檢測miRNAs過表達情況。與NC 組相比，miR-92a和miR-19b在MIN6細胞的表達量顯著升高（P＜0.01），見圖3。這表明miR-92a和miR-19b在MIN6細胞中被成功過表達。

3 miR-92a和miR-19b對MIN6細胞活力的影響

MIN6 細胞轉染48 h 后，倒置顯微鏡采集細胞圖像并通過CCK8 法檢測細胞活力。與NC 組相比，轉染miR-92a 和miR-19b 的MIN6 細胞形態和活力無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

4 miR-92a和miR-19b對胰島素表達的影響

將NC、miR-92a 和miR-19b 轉染MIN6 細胞48 h和72 h 后，通過qPCR、Western blot 和免疫熒光檢測胰島素的表達。qPCR 檢測顯示，與對照組相比，miR-92a和miR-19b顯著抑制Ins1和Ins2的mRNA表達（P＜0.01），見圖5。Western blot 和免疫熒光檢測結果顯示，miR-92a 和miR-19b 抑制insulin 蛋白表達（P＜0.01），見圖6。

5 miR-92a 和miR-19b 對NeuroD1 基因表達的影響

為分析miR-92a 和miR-19b 可能通過調控哪些基因而影響胰島素表達，我們通過生物信息學預測NeuroD1是miR-92a 和miR-19b 的靶基因，又通過雙螢光素酶報告基因實驗和Western blot，檢測到miR-19b 顯著抑制NeuroD1 3′UTR 螢光素酶活性和NeuroD1 蛋白表達（P＜0.01），而miR-92a 對NeuroD1 3′UTR 螢光素酶活性和NeuroD1 蛋白表達僅起到微調作用，與NC 組相比抑制作用無顯著差異（P＞0.05），見圖7。

Figure 2.The expression levels of endogenous miR-92a（A）and miR-19b（B）in MIN6 cells and pancreatic progenitor cells（PSC）were detected by qPCR.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs PSC.圖2 內源性miR-92a和miR-19b在MIN6細胞中的相對表達水平

Figure 3.Overexpression of miR-92a and miR-19b in MIN6 cells.A：the expression of miR-92a in the MIN6 cells was detected by qPCR after transfection for 48 h；B：the mRNA expression of miR-19b in the MIN6 cells was detected by qPCR after trans?fection for 48 h.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖3 miR-92a和miR-19b在MIN6細胞中的過表達

討 論

正常胰島β 細胞功能的維持受一系列基因、非編碼RNA 及細胞內信號通路的精確調控［14-15］。小鼠成熟β細胞特異性敲除Dicer后，β細胞面積降低，胰島素分泌減少，胰島功能喪失，小鼠呈現糖尿病癥狀［16-17］。miRNAs 在胰腺β 細胞增殖、發育、胰島素合成、分泌及糖尿病并發癥的發生發展過程中發揮重要作用，如miR-375、miR-26a、miR-124a 等［18-20］。為了探究miR-19b 和miR-92a 在胰島β 細胞中的功能，本文首先分析了胰島細胞中內源性miR-19b 和miR-92a 的表達情況。成體胰腺主要由成熟胰腺內分泌細胞、外分泌細胞、導管細胞和少量成體胰腺祖細胞構成。成體胰腺祖細胞具有分化為成熟胰腺細胞的潛能［12］。為分析終末分化細胞中基因相對表達量，我們以基因在成體胰腺祖細胞中的相對表達量為參考，檢測結果顯示，正常胰島細胞中內源性miR-19b和miR-92a 相對表達水平低；通過轉染外源miR-19b和miR-92a，使其在MIN6 細胞中過表達，結果表明miR-19b 和miR-92a 過表達對MIN6 細胞的活力沒有影響，但能抑制胰島素基因表達，解釋了胰島細胞內源性miR-19b和miR-92a表達水平較低的原因。

Figure 4.The effect of miR-92a and miR-19b on the morphological changes and viability of MIN6 cells.A：the images of the MIN6 cells under inverted optical microscope after transfection for 48 h（scale bar=100 μm）；B：the effect of miR-92a and miR-19b on the viability of the MIN6 cells after transfection for 48 h was measured by CCK8 assay.Mean±SEM. n=3.圖4 miR-92a和miR-19b對MIN6細胞形態和活力的影響

Figure 5.The effects of miR-92a and miR-19b on the mRNA ex?pression levels of Ins1 and Ins2.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖5 miR-92a和miR-19b對胰島素mRNA表達水平的影響

胰島素的表達受到胰島素轉錄調控因子調控，如胰島素轉錄促進因子Pdx1、NeuroD、Ngn3、配對盒蛋白6（paired box 6，Pax6）、NK2 型同源框蛋白2（NK2 homeobox 2，Nkx2.2）、NK6 同源框蛋白1（NK6 homeobox 1，Nkx6.1）等，胰島素轉錄抑制因子性別決定區Y 框轉錄因子6（SRY-box transcription factor 6，Sox6）、Hes 家族bHLH 轉錄因子1（Hes family bHLH transcription factor 1，Hes1）、INSM 轉錄抑制因子1（INSM transcriptional repressor 1，In?sm1）、Insm2 等，它們相互協調，調控胰島素表達，維持機體血糖穩態［14］。miRNAs 通過直接或間接調控胰島素基因、胰島素轉錄因子等調控胰島素表達，如：miR-30a 靶向抑制NeuroD1基因；miR-124a 通過靶向叉頭框蛋白A2（forkhead box A2，Foxa2）抑制Pdx1基因，進而抑制胰島素基因表達；miR-96 靶向沉默Sox6，進而促進β 細胞胰島素的合成與分泌［4，20-21］。生物信息學預測結果顯示，miR-19b 和miR-92a 與Ins1 和Ins2 mRNA 的3′UTR 無直接靶向作用位點，通過篩選，發現NeuroD1可能是miR-92a和miR-19b 的潛在靶基因。NeuroD1 促進胰腺內分泌細胞分化，維持細胞功能特性，是胰島素基因的關鍵轉錄調控因子［22-23］。NeuroD1缺陷小鼠胰腺β細胞大量凋亡，對高糖刺激應答能力降低，表現出糖尿病癥狀［24］。我們的進一步實驗證實，miR-19b 通過直接靶向NeuroD1基因抑制胰島素基因表達，而miR-92a 可能通過微調NeuroD1或靶向其他功能基因調控胰島素合成。

Figure 6.The effects of miR-92a and miR-19b on the protein expression level of insulin.A：the effects of miR-92a and miR-19b on the protein expression level of insulin were detected by Western blot after transfection for 72 h；B：the effects of miR-92a and miR-19b on the protein expression level of insulin were detected by immunofluorescence after transfection for 72 h（scale bar=100 μm）.Mean±SEM. n=3.**P＜0.01 vs NC group.圖6 miR-92a和miR-19b對胰島素蛋白表達水平的影響

miRNAs 異常表達將導致細胞功能紊亂。文獻報道，miR-92a 在2 型糖尿病患者血清中表達升高，且隨著病情進展而增高［18］；在穩定型冠心病合并糖尿病和慢性穩定性心絞痛合并糖尿病患者外周血清中miR-92a 顯著升高［25-26］；妊娠糖尿病患者血清miR-19b 和miR-19a 表達水平升高［27］，一般在妊娠16～19周降低［28］。已知血液中循環miRNA 可作為疾病診斷和預后評估的良好指標，miR-92a和miR-19b是否能作為糖尿病、肥胖癥等代謝疾病診斷和預后評估的指標有待跟蹤研究。miRNA 與lncRNA、circRNA、小分子物質、藥物等有作用關系，可能是他們調控細胞功能的靶點，例如：黃芪甲苷IV 通過下調miR-23a和miR-92a，激活PI3K/AKT和MAPK/ERK 信號通路，保護心肌細胞免受缺氧損傷。本研究揭示了miR-92a 和miR-19b 對β 細胞胰島素基因表達的調控，豐富了胰島β 細胞功能調控機制，為后續篩選調控胰島細胞功能的藥物、機制分析等科研工作奠定了基礎。

Figure 7.The effects of miR-92a and miR-19b on the expression of NeuroD1 gene.A：the effects of miR-92a and miR-19b on the lu?ciferase activity of NeuroD1 mRNA 3′UTR were detected by dual-luciferase reporter assay；B：the effects of miR-92a and miR-19b on the protein expression of NeuroD1 were detected by Western blot.Mean±SEM. n=3. **P＜0.01 vs NC group.圖7 miR-92a和miR-19b對NeuroD1基因表達的影響