附子理中湯減輕非酒精性脂肪肝大鼠炎癥損傷的機(jī)制研究*

馬 威，楊家耀△，安 柳，鄒 琦，章 消，劉 念

［1武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院（武漢市第一醫(yī)院），湖北武漢 430022；2湖北中醫(yī)藥大學(xué)，湖北武漢430065］

非酒精性脂肪肝（non-alcoholic fatty liver dis?ease，NAFLD）是全球肝病最重要的病因之一，在未來(lái)幾十年內(nèi)，NAFLD 可能成為終末期肝病的主要病因，嚴(yán)重影響成人及兒童［1］。NAFLD 已成為全球人類主要的健康負(fù)擔(dān)，其可導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌、糖尿病和心血管疾病等的風(fēng)險(xiǎn)增加［2］。研究顯示，NAFLD 的患病率與人民生活水平呈顯著正相關(guān)性，其已經(jīng)成為21 世紀(jì)全球公認(rèn)的公共健康問(wèn)題之一［3］。NAFLD 是臨床上常見(jiàn)的病理綜合征，目前針對(duì)NAFLD 的治療尚未有明確有效的方案［4］。近些年，有關(guān)NAFLD 發(fā)病的“多重打擊”學(xué)說(shuō)逐漸興起，其認(rèn)為NAFLD 是由飲食、遺傳和環(huán)境等因素共同作用的結(jié)果，其中，炎癥因子失衡是其病情發(fā)展過(guò)程中致肝細(xì)胞損傷的重要病理基礎(chǔ)，典型的炎癥反應(yīng)則是NAFLD 的主要病理表現(xiàn)之一［5］。Toll 樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）能激活核因子κB（nucle?ar factor kappa B，NF-κB），使其進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活靶基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生，引起一系列的細(xì)胞因子合成與釋放，觸發(fā)機(jī)體產(chǎn)生級(jí)聯(lián)式炎癥反應(yīng)，最終誘發(fā)一系列的免疫及炎癥反應(yīng)［6］。中醫(yī)療法在NAFLD 臨床治療上具有一定的優(yōu)勢(shì)，本課題前期研究發(fā)現(xiàn)附子理中湯（Fuzilizhong decoction）在NAFLD 細(xì)胞模型和動(dòng)物模型中均可發(fā)揮作用［7-8］。本研究在前期研究的基礎(chǔ)之上，從炎癥損傷方面探究附子理中湯對(duì)NAFLD模型大鼠的作用及機(jī)制。

材料和方法

1 動(dòng)物與主要試劑

48 只7～8 周齡雄性SPF 級(jí)SD 大鼠，體重（250±25）g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司［SCXK（遼）2017-0012］。易善復(fù)（Yishanfu）購(gòu)自賽諾菲北京制藥有限公司；附子理中湯配方為人參9 g，白術(shù)9 g，炙甘草6 g，干姜9 g，炮附子9 g，該方劑的中藥飲片購(gòu)于湖北天濟(jì)中藥飲片有限公司。檢測(cè)白細(xì)胞介素2（interleukin-2，IL-2）、腫瘤壞死因子α（tumor ne?crosis factor-α，TNF-α）和IL-6 含量的ELISA 試劑盒購(gòu)于武漢貝茵萊生物科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa；SYBR Green 染料購(gòu)自Lumiprobe Cor?poration；BCA 蛋白濃度檢測(cè)試劑盒和化學(xué)發(fā)光試劑購(gòu)自南京建成生物技術(shù)有限公司；兔抗TLR4抗體和兔抗NF-κB p65 抗體、兔抗p-NF-κB p65 抗體和兔抗GAPDH抗體購(gòu)自Abcam。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 構(gòu)建大鼠NAFLD 模型 采用脂肪乳灌胃法制備大鼠NAFLD 模型［9-10］。脂肪乳由A 液（25 g 豬油加熱溶解，加入10 g 膽固醇，攪拌后加入1 g 丙賽優(yōu)，混勻后加入25 mL 吐溫80）和B 液（取20 mL 丙二醇至30 mL 水中，加熱至60℃，加入2 g 脫氧膽酸鈉）混合而成。向脂肪乳中加水至100 mL，灌胃劑量為10 mL·kg?1·d?1，持續(xù)4周。

2.2 動(dòng)物分組及治療 48 只SD 大鼠隨機(jī)分為6組：（1）對(duì)照（control）組：10 mL·kg?1·d?1生理鹽水灌胃8 周；（2）模型（NAFLD model）組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，10 mL·kg?1·d?1生理鹽水灌胃4 周；（3）附子理中湯高劑量組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，20 mL·kg?1·d?1附子理中湯灌胃4 周；（4）附子理中湯中劑量組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4周，10 mL·kg?1·d?1附子理中湯灌胃4周；（5）附子理中湯低劑量組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，5 mL·kg?1·d?1附子理中湯灌胃4 周；（6）易善復(fù)組：10 mL·kg?1·d?1脂肪乳灌胃4 周，30 mL·kg?1·d?1易善復(fù)灌胃4 周。造模4 周后，各造模組中隨機(jī)挑選1 只大鼠進(jìn)行肝組織HE 染色后病理分析，鑒定模型是否成功。治療結(jié)束后，采用3%的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，取腹主動(dòng)脈血5 mL，分離血清；大鼠頸椎脫臼處死，取肝臟組織，多聚甲醛固定部分組織用于病理觀察，其余組織置于?80℃中保存。

2.3 HE 染色觀察病理學(xué)變化 將大鼠肝臟組織從固定液中取出，烘干脫水，浸蠟包埋。將包埋組織切成厚度為4 μm 左右的切片。烤片后，采用蘇木素、伊紅染液分別染色。流水沖洗后，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。中性樹(shù)膠封片后，于顯微鏡下觀察大鼠肝組織病理學(xué)變化。

2.4 ELISA 檢測(cè)血清IL-2、IL-6 及TNF-α 含量 取分離后的各組大鼠新鮮血清，分別按ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，檢測(cè)各組大鼠血清中IL-2、IL-6 和TNF-α的水平。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè)肝組織中TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 表達(dá) 加入Trizol 提取大鼠肝組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行RTqPCR。反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃5 s，56℃30 s，72℃25 s，共35 個(gè)循環(huán)。TLR4 的上游引物序列為5′-ACCT?GTCCCTGAACCCT-3′，下游引物序列為 5′-CTCCCAGAACCAAACGA-3′；NF-κB p65的上游引物序列為5′-GGGGACTACGACCTGAATG-3′，下游引物序 列 為5′-GGGCACGATTGTCAAAGAT-3′；GAPDH的上游引物序列為5′-CCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游引物序列為5′-CACCACCCTGTTGCTGT-3′。由上海生物工程有限公司合成。

2.6 Western blot 檢測(cè)肝組織中TLR4 及p-NF-κB p65蛋白的表達(dá) 提取大鼠肝組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg 蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE 分離后，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。封閉1 h，加入Ⅰ抗稀釋液（TLR4 稀釋比為1∶1 000；NF-κB p65 稀釋比為1∶2 000；p-NF-κB p65 稀釋比為1∶5 000；GAPDH 稀釋比為1∶2 500），室溫孵育1 h。PBS 清洗3 次，加入HRP 標(biāo)記的Ⅱ抗稀釋液（1∶5 000），室溫孵育0.5 h。PBS 清洗5 次，加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室中顯影曝光，根據(jù)灰度值計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，多組間比較選擇單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 NAFLD大鼠肝組織病理學(xué)的變化

HE 染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常，排列有序；模型組大鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)腫脹，排列無(wú)序，細(xì)胞間連接松散，細(xì)胞內(nèi)存在脂滴空泡，細(xì)胞核著色深并出現(xiàn)裂解，且有明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象；附子理中湯低、中、高劑量組肝細(xì)胞形態(tài)逐漸恢復(fù)，腫脹程度逐漸減輕，脂滴空泡現(xiàn)象逐漸減少，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)逐漸減少，且以附子理中湯高劑量組及易善復(fù)組大鼠肝組織損傷改善更佳。見(jiàn)圖1。

Figure 1.The effect of Fuzilizhong decoction on pathological changes of liver tissue in rats with NAFLD.圖1 附子理中湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織病理學(xué)變化的影響

2 NAFLD 大鼠血清炎癥因子IL-2、IL-6 及TNF-α水平的比較

ELISA 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清IL-2、IL-6 及TNF-α 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠血清IL-2、IL-6 及TNF-α 水平顯著降低（P＜0.05）；與附子理中湯低、中劑量組比較，附子理中湯高劑量組大鼠血清IL-2、IL-6 及TNFα 水平顯著降低（P＜0.05），提示附子理中湯對(duì)NAFLD 大鼠血清炎癥因子的抑制作用呈劑量依賴性。見(jiàn)表1。

3 附子理中湯抑制NAFLD 大鼠肝組織中TLR4 及NF-κB p65的表達(dá)

RT-qPCR 和Western blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肝組織中TLR4 和NF-κB p65 的mRNA 水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各治療組大鼠肝組織中TLR4 和NF-κB p65 的mRNA 顯著降低（P＜0.05）；與附子理中湯低、中劑量組比較，附子理中湯高劑量組大鼠肝組織中TLR4 及NF-κB p65 的mRNA 顯著降低（P＜0.05）。而各組肝組織中TLR4及p-NF-κB p65 的變化趨勢(shì)與mRNA 變化一致。見(jiàn)圖2、3。

表1 NAFLD大鼠血清IL-2、IL-6及TNF-α水平的比較Table 1.Comparison of serum levels of IL-2，IL-6 and TNF-α in rats with NAFLD（Mean±SD. n=7）

Figure 2.Comparison of the mRNA levels of TLR4 and NF-κB p65 in the liver tissues of rats with NAFLD.Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NAFLD model group；&P＜0.05 vs low dose of Fuzilizhong decoction group；$P＜0.05 vs middle dose of Fuzilizhong decoction group.圖2 NALFD大鼠肝組織中TLR4及NF-κB p65 mRNA表達(dá)水平的比較

討 論

NAFLD 是一種最普遍的肝臟疾病，全球的發(fā)病率約為25.24%［11］。研究證明，NAFLD的臨床負(fù)擔(dān)不僅局限于肝臟相關(guān)疾病，更是一種多系統(tǒng)疾病，可影響肝外器官和多種調(diào)節(jié)途徑［12］。目前，NAFLD 的發(fā)病機(jī)制尚未明確，接受度最高的機(jī)制為“二次打擊”學(xué)說(shuō)［13］。“二次打擊”學(xué)說(shuō)及其所致的炎癥反應(yīng)在NAFLD病理過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用［14］。臨床上多使用胰島素增敏劑、抗氧化劑和降脂藥物等進(jìn)行治療，由于這些藥物長(zhǎng)期使用多引發(fā)毒副作用，使得中草藥和天然產(chǎn)物成為人們尋找來(lái)治療NAFLD 的理想藥物［15-16］。

在中醫(yī)藥歷史中，并沒(méi)有以“脂肪肝”命名的疾病，脂肪肝被稱為“肝積”，其臨床表現(xiàn)可歸納為“肝痞”、“肝壅”、“脅痛”、“積聚”及“痰方”等范疇，其病位主要在肝臟，涉及脾臟與腎臟［8，17］。有學(xué)者認(rèn)為以溫陽(yáng)化氣為主，恢復(fù)其脾胃功能為肝積的治療方案［18］。中藥湯劑附子理中湯由人參、白術(shù)、炙甘草、干姜和炮附子制成，人參，其主要成分人參皂苷——具有抗氧化作用，可發(fā)揮保肝護(hù)肝功效［19］；白術(shù)可有效改善NAFLD 患者血脂水平，具有明顯的治療效果［20］；炙甘草活性成分甘草素具有抗氧化、抗炎和抗腫瘤活性，并具有抑制肝纖維化的作用［21］；而干姜可溫運(yùn)健脾，炮附子可回陽(yáng)救逆。臨床資料也顯示，采用中藥附子理中湯加痛瀉要方加味治療脂肪肝患者2 個(gè)月，可降低其血脂和轉(zhuǎn)氨酶，改善癥狀［22］。本研究結(jié)果也顯示，附子理中湯能改善NAFLD 大鼠肝臟損傷，有效降低血清炎癥因子水平。

Toll 樣受體家族（TLRs）是具有典型特征的一類模式識(shí)別受體，在激活先天性免疫應(yīng)答中起著重要作用［23］。TLR4 不僅能識(shí)別多種外源性配體，也能識(shí)別與炎癥、應(yīng)激和機(jī)體損傷等相關(guān)的內(nèi)源性配體，其與配體結(jié)合后主要通過(guò)活化髓樣分化因子88 依賴和非依賴性信號(hào)途徑，激活NF-κB 從而引發(fā)一系列的炎癥和免疫反應(yīng)［24］。在本研究中，附子理中湯可以抑制TLR4/NF-κB 信號(hào)通路，降低炎癥因子IL-2、TNF-α及IL-6在NAFLD模型大鼠血清中的水平。

Figure 3.The effect of Fuzilizhong decoction on the protein levels of TLR4 and p-NF-κB p65 in the liver tissues of rats with NAFLD.Mean±SD. n=7.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs NAFLD model group；&P＜0.05 vs low dose of Fuzilizhong decoc?tion group；$P＜0.05 vs middle dose of Fuzilizhong decoction group.圖3 附子理中湯對(duì)NAFLD大鼠肝組織中TLR4及p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平的影響

綜上所述，附子理中湯可減輕NAFLD 大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)，其可能的作用機(jī)制與抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。