黃芪甲苷對多囊卵巢綜合征大鼠性激素水平及氧化應激損傷的影響*

李艷青，趙 方，傅金英△，高 蕊，吳 昕，牛小斌

（1河南中醫藥大學第二附屬醫院婦科，河南鄭州 450003；2河南中醫藥大學研究生處，河南鄭州 450046；3河南中醫藥大學第二附屬醫院檢驗科，河南鄭州 450003）

多囊卵巢綜合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）是一種常見的婦科內分泌疾病，其臨床表現為持續性無排卵、高雄激素血癥、卵巢多囊樣改變及胰島素抵抗［1］。PCOS 的病因復雜，發病機理尚不明確，但有研究顯示，PCOS 患者較正常人體內的氧化應激（oxidative stress，OS）水平明顯升高［2-3］，提示OS可能是PCOS發病的潛在誘因，從抗氧化的角度認識該疾病可能會發現新的治療靶點。目前臨床治療PCOS 多以對癥治療為主（如達英-35 和氟他胺等），但療效有限且副作用大［4］。而中醫藥治療PCOS 療效溫和持久且不良反應少，已成為近些年的研究熱點［5］。

黃芪甲苷（astragaloside，AST）是一種從黃芪上提取出來的高純度藥物，具有免疫調節、器官保護、抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降糖及改善胰島素抵抗活性等多種生物活性［6-7］。由于黃芪甲苷含量少、效果好，藥效強度是黃芪多糖的2 倍以上而享有“超級黃芪多糖”的美稱，但目前尚無黃芪甲苷在治療PCOS 方面的報道。本研究擬通過來曲唑誘導建立PCOS 大鼠模型，觀察黃芪甲苷對PCOS 大鼠血清性激素、氧化應激水平及卵巢組織形態學的影響，探討其對PCOS 大鼠性激素水平和氧化應激損傷的影響，為黃芪甲苷治療PCOS提供實驗基礎。

材料和方法

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級雌性SD 大鼠60 只，6～7 周齡，體質量（180±20）g，由河南省實驗動物中心提供，合格證號SCXK（豫）2017-0002。大鼠飼養于河南中醫藥大學實驗動物中心，室內溫度（22±2）℃，相對濕度50%～70%。

1.2 主要試劑 黃芪甲苷（成都科程生物科技開發有限公，批號20180512）；來曲唑片（江蘇恒瑞醫藥股份有限公司，批號16113061）；達英-35（拜耳醫藥保健有限公司，批號333A）；蘇木素-伊紅（HE）染色液（蘇州卡爾文生物科技有限公司）；大鼠性激素睪酮（testosterone，T）、雌二醇（estradiol，E2），促黃體生成素（luteinizing hormone，LH）和卵泡刺激素（folliclestimulating hormone，FSH）ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSHPx）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；甾類激素合成急性調節蛋白（steroidogenetic acute regulatory pro?tein，StAR）、cleaved caspase-3、Bcl-2、Bax 和GAPDH抗體（Abcam，批號分別為ab-13897、ab-60232、ab-173054、ab-181602 和ab-186517）；過氧化物酶標記羊抗兔IgG（武漢博士德生物工程有限公司，批號BST12E27C55）。

1.3 儀器 680 型酶標儀（Bio-Rad）；TKY-BMC 石蠟包埋機（湖北泰康醫療設備有限公司）；RM2235切片機（Leica）；DYCZ-24DN 型電泳儀和DYCZ-40D 型轉膜儀（北京六一儀器廠）；Image-Pro Plus 6.0 圖像分析系統（Media Cybernetics）。

2 方法

2.1 動物造模及分組處理 將60 只大鼠適應性飼養1 周后，隨機分成正常對照（control）組、模型組（model）組、陽性對照達英-35（Diane-35）組，黃芪甲苷低劑量（low dose of AST，AST-L）組和黃芪甲苷高劑量（high dose of AST，AST-H）組，每組12 只。PCOS 造模方法參考前期研究［8］，具體操作為將1 mg/kg 來曲唑溶于質量分數1%的羧甲基纖維素（car?boxylmethyl cellulose，CMC）溶液中，連續灌胃21 d，制備PCOS 模型，其中正常對照組給予等量1%CMC灌胃。于造模第16 天開始對大鼠進行1 個周期（5 d）的陰道涂片觀察動情周期，若陰道上皮細胞持續角化為造模成功［9］。造模成功后開始灌胃給藥，根據前期預實驗結果，黃芪甲苷低劑量組和黃芪甲苷高劑量組大鼠分別給予12.5 mg/kg 和50 mg/kg 黃芪甲苷灌胃，而達英-35 組大鼠給予0.339 2 mg/kg 達英-35［9］灌胃，對照組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃，每天1次，連續3周。

2.2 陰道涂片觀察大鼠動情周期 實驗期間每天早上9 點用蘸有生理鹽水的無菌棉簽緩慢插入大鼠陰道，輕輕地在大鼠陰道內旋轉2 圈并將其順時針均勻地涂在載玻片上，行陰道涂片后自然干燥，蘇木素染色，于顯微鏡下觀察細胞種類和形態，同時觀察大鼠陰道口徑的變化及充血狀態，結合陰道涂片檢查結果，判斷大鼠性周期的各個時期。

2.3 計算卵巢指數 末次給藥后，摘取雙側卵巢和雙角子宮，用鑷子仔細分離并去除臟器表面脂肪組織，濾紙吸拭表面，用分析電子天平稱量質量。卵巢指數=兩側卵巢總質量（mg）/大鼠體質量（g）。

2.4 HE 染色觀察卵巢組織病理學變化 摘取各組大鼠左側卵巢組織，放入4%多聚甲醛中固定24 h，經脫水處理后進行常規石蠟包埋，制作3～4 μm 石蠟切片，行HE 染色，于顯微鏡下觀察卵巢組織形態并拍照。

2.5 ELISA 檢測血清中性激素含量 取各組大鼠血清，按照試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀在450 nm 波長處測定各孔的A值，根據標準曲線計算血清中T、E2、LH和FSH的含量。

2.6 比色法檢測血清及卵巢組織中SOD、MDA 和GSH-Px 水平 取血清及卵巢組織稱質量，組織碾磨至勻漿，4℃、10 000×g離心15 min，取上清液。按照試劑盒操作說明書加入相應試劑，孵育后測各樣品吸光度值，根據試劑盒說明書提供的計算公式分別計算MDA和GSH-Px含量及SOD活性。

2.7 Western blot檢測 稱取適量卵巢組織，加入裂解液充分研磨后置于冰浴中勻漿，然后在4℃、10 500×g條件下離心20 min，收集上清液，BCA 法測定上清液中蛋白含量。取等量蛋白樣品進行SDSPAGE，隨后轉移至PVDF 膜，用5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，洗膜，加入Ⅰ抗（StAR、cleaved caspase-3、Bax、Bcl-2 和GAPDH 抗體均1∶1 000 稀釋），4℃搖床過夜，次日加入HRP標記的Ⅱ抗，室溫孵育1 h，最后使用ECL 顯色。利用ImageJ 圖像分析軟件進行分析，結果用灰度值表示，以目的條帶與GAPDH 的灰度值比值，作為目的蛋白表達的相對水平。

3 統計學處理

通過SPSS 22.0 軟件進行處理，結果以均數±標準差（meas±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 表示差異有統計學意義。

結 果

1 黃芪甲苷對PCOS模型大鼠動情周期的影響

如表1 所示，對照組大鼠動情周期正常有規律；模型組大鼠動情周期紊亂，動情期消失，動情前期時間延長，說明PCOS 大鼠模型構建成功；黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠大部分處于動情期，周期恢復規律；黃芪甲苷低劑量組大鼠大部分仍處于動情前期階段，動情期大鼠較少。

表1 各組大鼠動情周期比較Table 1.Comparison of the estrous cycles of rats in each group（n=12）

2 黃芪甲苷對PCOS模型大鼠卵巢指數的影響

如表2 所示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢指數顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢指數顯著減少（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

3 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠卵巢組織病理結構的影響

如圖1 所示，對照組大鼠卵巢表面色澤偏紅，表面可見黃體，未見囊狀擴張卵泡；模型組和黃芪甲苷低劑量組大鼠卵巢體積變大，表面蒼白，少見黃體，可見多個囊狀擴張卵泡；黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢體積變小，表面色澤較紅潤可見黃體，囊狀卵泡擴增不明顯。

4 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠血清性激素水平的影響

如表3 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清中T 和LH 含量顯著增加（P＜0.05），E2和FSH 含量顯著減少（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠血清中T 和LH 含量顯著減少（P＜0.05），E2和FSH 含量顯著增加（P＜0.05）；而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

表2 各組大鼠卵巢指數比較Table 2.Comparison of the ovarian index of rats in each group（mg/g.Mean±SD. n=12）

5 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠血清及卵巢組織中氧化應激水平的影響

如表4 和表5 所示，與對照組比較，模型組大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量顯著增加（P＜0.05），GSH-Px和SOD 活性顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35 組大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量顯著減少（P＜0.05），GSH-Px 和SOD 活性顯著升高（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

Figure 1.Pathological changes of ovarian tissue sections（HE staining，scale bar=50 μm）.A：control group；B：model group；C：Diane-35 group；D：AST-L group；E：AST-H group.The ovaries of rats in groups B and D were enlarged，with pale sur?face，rare corpus luteum，and multiple cystic dilated follicles.圖1 各組大鼠卵巢組織切片病理觀察

表3 各組大鼠血清性激素水平比較Table 3.Comparison of serum levels of sex hormones in rats（Mean±SD. n=12）

6 黃芪甲苷對PCOS 模型大鼠卵巢組織中StAR 及cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達的影響

如圖2 和表6 所示，與對照組比較，模型組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著上調（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著下調（P＜0.05）；與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組和達英-35組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved-caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著下調（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平顯著上調（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組無顯著變化（P＞0.05）。

表4 各組大鼠血清中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比較Table 4.Comparison of the levels of MDA，GSH-Px and SOD in serum of rats in each group（Meas±SD. n=12）

表5 各組大鼠卵巢組織中MDA含量、GSH-Px活性及SOD活性的比較Table 5.Comparison of the levels of MDA，GSH-Px and SOD in ovarian tissue of rats in each group（Mean±SD. n=12）

Figure 2.The protein expression of StAR，cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in ovarian tissue detected by Western blot.圖2 Western blot 檢測卵巢組織中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表達

討 論

OS 是由于機體自由基產生過多，自身清除自由基的能力下降，導致機體氧化和抗氧化失衡而引發的組織損傷。OS 不僅在慢性炎癥、腫瘤、老化及各種代謝性疾病中發揮著重要作用，也與PCOS的發生發展密切相關［10］。有研究報道［11］，OS 損傷可導致卵泡發育受損、成熟障礙和卵泡閉鎖；同時也有研究提出［12］，OS 可增強卵巢雄激素相關合成酶StAR 的表達，刺激雄性激素的產生和釋放，從而導致PCOS 發生。這些研究提示OS 可能是PCOS 的發病機制之一，減輕OS 可能是PCOS 治療的潛在方法。黃芪甲苷作為傳統中藥黃芪的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、擴血管和改善心腦缺血性疾病等作用［13］，但黃芪甲苷是否對PCOS 造成的氧化應激損傷以及性激素水平有一定的作用，尚未見報道。本研究結果顯示，黃芪甲苷能通過下調PCOS大鼠機體的氧化應激水平，抑制StAR 的表達，調節血清性激素水平，減少卵巢組織細胞凋亡，從而發揮對PCOS模型大鼠的保護作用。

PCOS 是一種常見的排卵障礙性疾病，其卵泡發育異常主要表現為過多的早期卵泡生長。本研究結果顯示，PCOS 模型大鼠動情周期紊亂，卵巢指數顯著增加，卵巢組織形態學觀察結果表明，模型大鼠卵巢內可見較多囊狀擴張卵泡，未見黃體，提示無排卵，與臨床PCOS 患者病理表現相符［14］，說明本研究成功建立了來曲唑誘導的PCOS大鼠模型，該模型的核心病理機制可能是由于卵泡不能發育成熟和卵泡壁的過度增生不能破裂，導致卵泡閉鎖造成的。給與高劑量黃芪甲苷治療后，模型大鼠動情周期恢復規律性變化，卵巢指數趨于正常，卵巢內少見囊狀擴張卵泡，黃體有所恢復，提示黃芪甲苷能夠顯著改善PCOS 模型大鼠的排卵狀況。正常生理狀態下卵泡的生長發育在多種性激素的調控下精密有序地進行，包括T、LH、E2和FSH［15］。PCOS 患者通常表現出復雜的內分泌異常，其中以高血清T 和LH 以及低血清E2和FSH 為主要特征［16-17］。本研究結果顯示，PCOS 大鼠血清T 和LH 含量顯著增加，而E2和FSH含量顯著減少，與前人研究一致。而給與高劑量黃芪甲苷治療后，模型大鼠血清T 和LH 含量下降，E2和FSH 含量回升，說明黃芪甲苷能夠顯著平衡PCOS模型大鼠的血清激素水平。

表6 各組大鼠卵巢組織中StAR、cleaved caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白相對表達水平Table 6.Relative protein expression levels of StAR，cleaved caspase-3，Bax and Bcl-2 in rat ovarian tissue in each group（Meas±SD. n=12）

OS 被認為是PCOS 的潛在誘因，OS 能加重高雄激素的發生，而高雄激素血癥被認為是PCOS的典型特征之一［18］。MDA 是脂質過氧化產物，可反映機體氧化損傷的程度；SOD 和GSH-Px 是兩種主要的抗氧化劑，在維持機體的氧化-抗氧化動態平衡中起著重要作用，可將其作為抗氧化能力的檢測指標。本研究結果顯示，PCOS模型大鼠血清及卵巢組織中均出現MDA 含量明顯升高，GSH-Px 和SOD 活性明顯降低的現象，與Seyyed 等［19］的研究結果一致，表明OS確實參與PCOS 進程的調控。高劑量黃芪甲苷治療后，PCOS 大鼠血清及卵巢組織中MDA 含量明顯下調，GSH-Px 和SOD 活性明顯上升，提示黃芪甲苷治療能有效改善其氧化應激水平。卵泡顆粒細胞參與了卵巢卵泡的發育、成熟、閉鎖及卵巢性激素的正常分泌過程，其凋亡被認為是PCOS卵泡退化的根本原因［20］。本研究結果顯示，PCOS 模型大鼠卵巢組織中cleaved caspase-3 和Bax 蛋白水平顯著上調，Bcl-2 蛋白顯著下調，而高劑量黃芪甲苷治療能逆轉這類凋亡蛋白的表達變化，說明黃芪甲苷能減少卵巢細胞的凋亡，改善PCOS癥狀。為進一步明確黃芪甲苷改善PCOS氧化應激損傷的具體靶點，本研究對各組大鼠卵巢組織中StAR 蛋白表達水平進行了檢測，研究結果顯示，模型組大鼠卵巢組織中StAR 蛋白表達明顯增加，高劑量黃芪甲苷處理后StAR 蛋白表達顯著減少。提示黃芪甲苷可通過抑制OS發生，減少StAR的表達，調節性激素水平，從而改善PCOS。

綜上所述，黃芪甲苷可通過發揮抗OS 功效，下調StAR 蛋白表達，調節血清性激素水平，緩解卵巢增生程度和病理改變，從而發揮對來曲唑致PCOS模型大鼠的保護和調節作用，為黃芪甲苷應用于治療PCOS提供了實驗基礎。