血循環腫瘤細胞及循環游離DNA在乳腺癌臨床應用的研究進展

娜 仁，賈永峰

(內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010000)

乳腺癌是一種以乳房腫塊、乳頭溢液和腋窩淋巴結腫大等為臨床特征的常見婦科惡性腫瘤，流行病學研究顯示，2018年全球185個國家和地區新增乳腺癌患者208.9萬例，其中52.9%在發展中國家；死亡62.7萬例，位于癌癥死亡率的第五位，給患者的身體健康造成嚴重威脅[1，2]。隨著診療水平的不斷提高，乳腺癌患者的生存期明顯延長，但因腫瘤復發及轉移的影響，其死亡率仍居高不下[3]。因此，尋找與疾病病理生理學相關的標志物，對乳腺癌的早期診斷、腫瘤復發及轉移的早期識別具有重要意義。近年來研究證實，循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTCs)和循環游離DNA(cell-free DNA，DNA)參與了腫瘤的復發及轉移過程，對乳腺癌的臨床診斷、治療方案的制定及預后評估具有重要價值[4，5]。本文主要就CTCs、cfDNA在乳腺癌臨床應用的研究進展進行綜述。

1 CTCs、cfDNA概述

1.1 CTCsCTCs是一種因腫瘤原發灶或轉移灶脫落侵入機體外周血液循環系統的腫瘤細胞，早在1869年Ashworth[6]就在1例乳腺癌患者的外周血中發現了CTCs。CTCs具有與腫瘤異質性相關的抗原蛋白質和遺傳變異表達，這一特性使CTCs成為“液體活檢”的重要檢測指標，可為臨床腫瘤的診斷和檢測治療提供準確信息[7]。多項臨床研究表明，除乳腺癌外，CTCs也在卵巢癌、結直腸癌和肺癌等腫瘤疾病的診療中發揮重要作用，有望成為腫瘤疾病診斷及實時療效評估的標志物[8～10]。

1.2 cfDNAcfDNA是循環體液中游離于細胞外的高度片段化DNA，主要由凋亡、壞死或正常的細胞主動或被動裂解后釋放出，在健康人群血漿中含量較少(1～100 ng/ml)，片段較短(166 pb)[11]。腫瘤患者因核酸酶活性降低，導致cfDNA的清除率下降，故患者血漿中cfDNA一般呈高水平表達狀態[12]。研究發現，cfDNA可攜帶相關細胞來源的遺傳信息，能夠在一定程度上反映實體腫瘤組織中的基因突發圖譜頻率，有利于腫瘤的早期診斷、療效評價及復發轉移[13]。此外，cfDNA半衰期較短，與常規的血清腫瘤標志物相比，更有利于腫瘤的實時動態監測[14]。

2 CTCs、cfDNA的檢測方法

2.1 CTCs的研究手段相關動物模型實驗研究[15]發現，腫瘤疾病發展過程中，大量腫瘤細胞被釋放至血液循環中形成CTCs。但受血流剪切力、自身免疫系統和失巢凋亡效應的影響，僅有少數腫瘤細胞能逃過宿主免疫攻擊，成功侵入遠處器官，最終形成轉移病灶，故外周血中CTCs的數量極少[16]。為提高CTCs的檢出率，在檢測前通常對CTCs進行富集，相關富集方法主要有密度梯度離心法、濾過分離法、免疫磁珠分離法、流式細胞術、Can Patrol系統和液滴微流體技術等。其中，密度梯度離心法、濾過分離法和免疫磁珠分離法是第一代檢測方法，主要根據CTCs的密度、體積、表面電荷等特點進行分離[17]。流式細胞術和Can Patrol系統屬于第二代檢測方法，Can Patrol系統結合了納米技術和多重RNA原位分析技術，在提高CTCs回收率的同時，實現了對所有腫瘤表型CTCs的分離與鑒定[18]。液滴微流體技術是在第二代基礎上研發出來的可對單個細胞進行分離的技術，該技術中，每個液滴均可作為獨立的微反應器，大大降低了樣品與試劑的消耗，檢測敏感性和特異性更高，目前相關報道主要見于在肺癌中的臨床應用[19]。在乳腺癌研究中，常用的檢測方法主要包括流式細胞術、Cell Search系統、免疫熒光原位雜交和液滴微流體技術等。

2.2 cfDNA的研究手段單鏈構象多態性分析PCR法、限制性片段長度多態性PCR法是既往常用的cfDNA檢測方法，但由于其檢測敏感度較低，逐漸被數字PCR法和測序技術取代。數字PCR法是一種核酸分子絕對定量技術，該技術將單個DNA于微反應器中進行擴增，根據反應器呈現的不同熒光信號，結合相對比例和反應器體積計算出cfDNA原始濃度，從而實現cfDNA的絕對定量檢測[20]。數字PCR法無需擴增標準曲線，檢測速度較快，具有更高的靈敏度和準確度，但其局限性在于僅能對cfDNA已知的突變類型進行分析。測序技術可對指定區域或全部基因進行深度分析，以獲取更多的腫瘤基因遺傳多態性信息。當前常用的標記擴增深度測序、癌癥個體化深度測序等均屬于第二代測序技術。研究發現，在保證cfDNA足量的情況下，檢測靈敏度、特異度與測量深度呈明顯正相關，所獲取的腫瘤遺傳信息也隨著測序深度的升高逐漸增多，但檢測成本及時間也隨之增加[13]。因此，臨床應用時應根據研究目的及材料進行選擇。

3 CTCs、cfDNA檢測在乳腺癌中的臨床應用

3.1 CTCs、cfDNA與乳腺癌的早期診斷乳腺癌早期幾乎無明顯癥狀，傳統影像學檢查在疾病早期無法及時識別，存在漏診的風險。而早期乳腺癌的5年生存期遠遠高于晚期，若及時對乳腺癌進行鑒別診斷，并接受積極的治療，患者的總體生存率及預后質量可明顯提高[21]。因此，早期診斷對乳腺癌的治療及預后具有重要意義。CTCs、cfDNA檢測是乳腺癌診斷極具潛在價值的生物學指標，張瀟分等[22]研究了47例乳腺癌患者外周諸血CTCs、cfDNA表達水平，研究發現乳腺癌患者的CTCs水平為(13.98±12.36)個/ml，血漿cfDNAAlu247/115指數水平為(0.769±0.387)，均明顯高于良性乳腺疾病患者和健康體檢者；當CTCs截斷值為7.68個/ml時，診斷靈敏度、特異度分別為80.4%、96.4%；cfDNAAlu247/115截斷值取0.431時，診斷靈敏度、特異度分別為71.7%%、71.4%，而二者聯合檢測可進一步提高檢測效率。Jin等[23]研究發現，乳腺癌患者的CTCs陽性表達率明顯高于良性乳腺疾病患者和健康者，且CTCs的表達水平與乳腺癌患者的腫瘤類型、分期、大小及淋巴結轉移存在相關性，認為CTCs可作為乳腺癌篩查和分期診斷的輔助指標。Winn等[24]采用靶向測序技術檢測19例乳腺癌患者的血漿cfDNA水平，發現cfDNA中測得的基因圖譜與腫瘤組織的基因圖譜是互補的，可見cfDNA對乳腺癌具有良好的診斷價值。

3.2 CTCs、cfDNA與乳腺癌的治療及復發轉移乳腺癌的臨床治療以精準化及綜合性為治療原則，根據患者的身體狀況及腫瘤生物學特征，主要采用藥物治療、放療、手術治療或多種治療方法聯合應用等[25]，如何多元評價療效、準確預測腫瘤的復發轉移，以避免無用的毒性治療，為臨床治療方案的制定提供補充信息，已成為當前的研究熱點。徐彬等[26]對6例接受手術治療的乳腺癌患者的外周血CTCs表達水平進行監測，發現與術前相比，3例T2期乳腺癌患者術后3、6個月時的CTCs水平呈現下降趨勢，且均為出現復發和轉移；3例T3期乳腺癌患者術后3、6個月時的CTCs水平呈升高趨勢，術后均出現了復發和轉移，提示CTCs高檢出率與患者手術療效、術后復發轉移相關。NI等[27]應用CanPatrolTM技術對接受新輔助化療的早期乳腺癌患者的CTCs水平進行檢測，發現新輔助化療后CTCs陽性患者由29例減少到8例，其中化療方案EC-T(表阿霉素/環磷酰胺+多西紫杉醇)、TEC(多西紫杉醇/表阿霉素/環磷酰胺)分別將CTCs陽性患者從16例、13例減少到3例、5例，且CTCs的轉陰率與客觀緩解率存在明顯相關性。一項有關CTCs、cfDNA檢測對局部晚期乳腺癌患者新輔助化療療效的預測研究[28]顯示，存在高客觀緩解率的患者，其CTCs、cfDNAAlu11濃度與治療前持平，無明顯增加；而低客觀緩解率患者的CTCs、cfDNAAlu11濃度在新輔助化療期間持續增加，認為新輔助治療過程中，cfDNA濃度變化趨勢與CTCs相似，二者均可作為預測乳腺癌治療療效的有效指標。

3.3 CTCs、cfDNA與乳腺癌的預后癌坯抗原、糖類抗原125等血清腫瘤標志物是臨床常用的乳腺癌預后評估指標，但由于缺乏權威的證據支持，臨床不建議將其應用于乳腺癌的術后隨訪復查及預后評估中[29]。2018年，美國癌癥聯合委員會指南在激素受體、人表皮生長因子受體2、細胞增殖因子Ki67和腫瘤組織學分級的基礎上，將CTCs列為乳腺癌預后評估指標[30]。馬有龍等[31]研究證實CTCs陽性表達率與中晚期乳腺癌化療患者的預后存在相關率，他發現化療敏感患者化療4周后、研究終點時的外周血CTCs陽性率明顯低于化療不敏感患者，且CTCs對患者預后的預測具有較高的靈敏度和特異度。Aguilar等[32]評估了27例轉移性乳腺癌化療患者cfDNA基因組不穩定性(genomic instability，GIN)，研究發現隨著GIN的升高，患者總生存期(OS)有降低的趨勢，治療后3周的高GIN值與患者的OS、進展生存期(PFS)惡化顯著相關；GIN值在疾病穩定患者中的下降程度明顯高于進展患者。以上結果表明，治療早期對乳腺癌患者cfDNA的GIN值進行檢測，有利于患者PFS和OS的預測。一項Meta分析研究[33]也發現，cfDNA與乳腺癌的進展生存期、總生存期較短顯著相關；亞組分析結果顯示，cfDNA是預測乳腺癌患者預后的良好指標。

4 總結與展望

近年來，隨著對CTCs、cfDNA研究的深入，有關其在腫瘤的早期診斷、用藥指導、復發轉移監測及預后評估中已取得較大進展。盡管CTCs檢測前的富集操作大大提高了CTCs的檢出率，但受不同分子學方法檢測CTCs的異質性影響，以及內外部質量控制的影響，乳腺癌CTCs的檢測方法尚未達成共識，陽性率差別較大；當前，cfDNA檢測仍處于研究階段，二代測序技術雖可做到高通量，但全外顯子組測序成本較高高，難以在臨床應用中推廣，且該技術的應用缺乏規范化的管理，仍需大規模、前瞻性臨床研究驗證其可行性。在未來的研究中，一方面應開展多中心大樣本調研，為CTCs、cfDNA在乳腺癌的臨床應用提供參考依據；另一方面應進一步篩選敏感度和特異度更高的生物學指標，與CTCs、cfDNA進行聯合檢測，在實現乳腺癌早期診斷的同時，為乳腺癌的治療提供精確靶點，從而提高治療有效性。