高抗氧化活性大果山楂發酵液的發酵工藝優化

程天德 謝慶彤 游麗君

(1. 清遠職業技術學院食品藥品學院，廣東 清遠 511510；2. 華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640)

大果山楂是一種有著悠久歷史的藥食兩用水果，與中國傳統中藥山楂具有相似的成分和功效，在歐洲、中國和美國等地均有種植，已被證實具有抗氧化和降血脂等功效[1-3]。大果山楂既可鮮食，也可加工成山楂粉、山楂果脯、山楂干、山楂餅、山楂酒、山楂醋、山楂罐頭等[4-6]。雖然大果山楂具有較高的營養價值，但由于大果山楂的味道酸澀，山楂干、山楂餅等粗加工產品難以被消費者廣泛接受，因此需要研究可以改善大果山楂風味的深加工技術。楊靜云等[7]研究了山楂固態發酵工藝，王彥安[8]研究了山楂果醋發酵工藝，張巧等[9-10]研究了大果山楂酵素發酵工藝，上述研究結果均表明大果山楂經發酵處理后風味得到了改善，但由于其采用的是固態發酵工藝和自然菌種發酵，加工過程耗時長，產品質量不穩定，且沒有對能夠體現大果山楂主要功效的抗氧化能力進行系統研究，不利于產品的功能性評價。為了深入研究大果山楂液體深層發酵工藝，得到質量穩定、總體抗氧化能力強的大果山楂發酵液，研究擬采用主成分分析法構建大果山楂發酵液抗氧化能力綜合評價模型，以大果山楂發酵液的綜合抗氧化能力值為評價指標，優化高抗氧化活性大果山楂發酵液的發酵工藝條件，旨在為大果山楂抗氧化類功能食品的研究與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 大果山楂

采摘于廣東省連山縣某大果山楂種植基地(2019年10月)，鮮大果山楂采摘后于4 ℃冰箱中保存待用。

1.2 主要試劑

鼠李糖乳桿菌(CBS98073)：廣東環凱微生物科技有限公司；

福林酚試劑、2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)：分析純，美國Sigma公司；

沒食子酸、兒茶素、維生素E水溶性類似物(Trolox)：標準品，美國Sigma公司；

熊果酸、抗壞血酸：標準品，上海純晶生化科技股份有限公司；

四氯對苯醌、硼氫化鈉：分析純，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.3 主要儀器

高速組織搗碎機：DS-1型，上海精科實業有限公司；

高壓滅菌鍋：LDZF-100L-III型，上海申安醫療器械廠；

多功能提取濃縮機組：EC-02A型，杭州恩創機械有限公司；

發酵罐：ZY-800型，上海紫裕生物科技有限公司；

離心機：TGL-20M型，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；

分光光度計：UV1800型，上海菁華科技儀器有限公司；

氮吹儀：PGG-01G型，天津艾維歐科技發展有限公司；

旋渦混合儀：MS1型，德國IKA公司；

多功能酶標儀：Filter Max F型，美國Molecular公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌種活化培養 鼠李糖乳桿菌于-80 ℃冰箱中保存備用，試驗前將鼠李糖乳桿菌接種到MRS肉湯培養基中活化傳代，37 ℃靜置培養24 h，取培養液于4 ℃、4 500 r/min 離心20 min，收集菌體，用0.85%的生理鹽水洗滌2次，混勻制成菌懸液(>109CFU/mL)供后續試驗使用。

1.4.2 發酵工藝

(1) 工藝流程：

大果山楂→洗凈→去核→打漿→調配→滅菌→接種→發酵→離心→大果山楂發酵液

(2) 操作要點：選取設定量的大果山楂清洗晾干，去核去梗打漿后置于60 L 0.2%的抗壞血酸溶液中護色，加入2.5 kg白砂糖混合均勻后轉移至100 L發酵罐中，121 ℃ 滅菌20 min，冷卻至室溫，用2 mol/L的HCl(或NaOH)溶液調節pH至設定值，接入設定量的鼠李糖乳桿菌(LGG)菌懸液，于設定溫度下進行發酵。

1.4.3 指標測定

(1) 總酚含量：采用Folin-Ciocalteu比色法[11]，分別采用50，100，150，200，250，300 μg/mL的沒食子酸溶液在760 nm下制作沒食子酸標準曲線。線性回歸方程為y=0.376x+0.032，R2=0.999 2。

(2) 總黃酮含量：采用硼氫化鈉—四氯苯醌(SBC)比色法[12]，分別采用0.50，1.00，1.50，2.00，2.50，3.00 mg/mL 的兒茶素標準溶液在490 nm下制作兒茶素標準曲線。線性回歸方程為y=0.481 7x+0.005 3，R2=0.998 9。

(3) 總叁萜含量：參照Khishova等[13]的方法進行測定，分別采用10，20，30，40，50 μg/mL的熊果酸標準溶液在548 nm下制作熊果酸標準曲線。線性回歸方程為y=0.011 2x+0.056，R2=0.995 6。

(4) 氧自由基吸收能力(ORAC)：參照Wen等[14]的方法進行測定，以Trolox為標準品制作標準曲線，每個樣品平行測定3次取平均值。樣品的ORAC值表示為每克大果山楂干重的Trolox當量(μmol TE/g DW)。

(5) 過氧自由基清除能力(PSC)：參照Adom等[15]的方法進行測定，以現配的抗壞血酸(VC)和沒食子酸(GA)為抗氧化標準物質，以磷酸緩沖溶液代替抗氧化物質進行空白試驗，每個樣品平行測定3次取平均值。樣品的PSC值表示為每克大果山楂干重的VC當量(μmol VCE/g DW)。

(6) DPPH自由基(DPPH·)清除率：參照Blois[16]的方法進行測定，將待測樣品溶液與2×10-4mol/L的DPPH溶液等體積混合，室溫下靜置30 min，以蒸餾水作為參比，于517 nm下測定吸光度，通過計算得出DPPH自由基清除率。

(7) ABTS自由基(ABTS+·)清除率：參照王存堂等[17]的方法進行測定，取5 mL 7×10-3mol/L的ABTS，加入8.8 μL 1.4 mol/L的K2S2O8，充分混合后靜置16 h即得ABTS工作液。分別取50 μL待測液(相同濃度發酵液)和5 mL ABTS工作液于試管中，搖勻靜置10 min后于734 nm處測定吸光度，以不加樣品的ABTS工作液作為參比，平行測定3次取平均值，通過計算得出ABTS自由基清除率。

1.4.4 抗氧化能力綜合評價模型的建立 按20 g/100 mL發酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL發酵液的LGG接種量，在25 ℃、初始pH 6.0的條件下發酵56 d，每7 d取樣一次，4 500 r/min離心10 min，取上清液檢測其總黃酮含量、總酚含量、總三萜含量、ORAC、PSC、DPPH·和ABTS+·清除能力。參照程天德等[18]的方法進行主成分分析，構建大果山楂發酵液抗氧化能力綜合評價模型。

1.4.5 單因素試驗

(1) 大果山楂添加量對發酵液抗氧化活性的影響：在25 ℃、初始pH 6.0、LGG接種量5 mL/100 mL發酵液的條件下，分別按5，10，15，20，25 g/100 mL發酵液的量添加大果山楂。

(2) LGG接種量對發酵液抗氧化活性的影響：在25 ℃、初始pH 6.0、大果山楂添加量20 g/100 mL發酵液的條件下，分別按1，3，5，7，9 mL/100 mL發酵液的濃度接種LGG菌懸液。

(3) 發酵溫度對發酵液抗氧化活性的影響：在20 g/100 mL 發酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL發酵液的LGG接種量、初始pH 6.0的條件下，分別在15，20，25，30，35 ℃下進行發酵。

(4) 初始pH對發酵液抗氧化活性的影響：在25 ℃、20 g/100 mL發酵液的大果山楂添加量、5 mL/100 mL發酵液的LGG接種量的條件下，分別以pH 2.0，3.0，4.0，5.0，6.0的初始pH進行發酵。

每組樣品均發酵56 d，每7 d取樣一次，4 500 r/min離心10 min，取上清液檢測其總黃酮含量、總酚含量、總三萜含量、ORAC、PSC、DPPH·清除率和ABTS+·清除率，采用大果山楂發酵液抗氧化能力綜合評價模型計算出發酵液的抗氧化能力綜合評價得分。

1.4.6 響應面優化試驗 在單因素試驗的基礎上，以大果山楂添加量、LGG接種量、發酵溫度和初始pH為主要影響因素，以發酵液的抗氧化能力綜合評價得分為評價指標設計響應面試驗，確定最優的高抗氧化活性大果山楂發酵液發酵工藝條件。

1.5 數據分析

采用Excel軟件進行數據統計分析，用Design-Expert 8.0軟件進行響應面分析，各組試驗結果數據均以平均數表示。

2 結果與分析

2.1 抗氧化能力綜合評價模型

2.1.1 抗氧化指標檢測結果 大果山楂發酵液中主要抗氧化指標檢測結果如表1所示。由表1可知，隨著發酵時間的延長，總酚、總黃酮和總叁萜含量都有不同程度的提高，發酵液的ORAC、PSC、DPPH·清除率和ABTS+·清除率也隨之提高，說明在試驗設定的發酵期限內，大果山楂發酵液的抗氧化能力有所提高。

表1 大果山楂發酵液主要抗氧化指標檢測結果Table 1 Test results of main antioxidant indexes of Malus doumeri fruits fermented beverage

2.1.2 抗氧化指標統計分析 大果山楂發酵液的抗氧化指標統計分析結果如表2所示。由表2可知，ABTS+·清除率、DPPH·清除率和總黃酮含量3個指標的變異系數較高，分別達到26.67%，16.30%，13.39%，其他指標的變異系數均低于5%。

表2 大果山楂發酵液的抗氧化指標統計分析結果?Table 2 Statistical analysis results of antioxidant index of Malus doumeri fruits fermented beverage

2.1.3 抗氧化能力綜合評價的主成分分析 為了消除7種抗氧化指標之間的量綱和數量級差異，采用標準差標準化法對各指標的檢測數據進行標準化處理，即：

(1)

式中：

k——該指標的標準化值；

X——該指標的測定值；

b——該指標的標準差(SD)。

從表3可以看出，前3個主成分的累計方差貢獻率已經達到82.36%，基本涵蓋了7項主要抗氧化指標的數據信息，達到了提取主成分因子的標準，因此選取前3個主成分。

表3 特征值與方差貢獻率Table 3 Contribution rate of characteristic value and variance

2.1.4 抗氧化能力綜合評價模型 由表4可知，決定第1主成分的主要是總黃酮含量、PSC和DPPH·清除率，決定第2主成分的主要是總酚含量、ORAC、PSC和DPPH·清除率，決定第3主成分的主要是總三萜含量、ABTS+·清除率和DPPH·清除率，推測可能是因為指標之間的相關性比較高，這些指標才會出現在同一主成分中。

根據表4中主成分的特征向量，可將3個主成分分別表示為：

表4 主成分的特征向量?Table 4 Eigenvectors of principal components

第1主成分：F1=-0.132X1+0.723X2+0.032X3-0.187X4+0.626X5+0.586X6+0.118X7；

(2)

第2主成分：F2=0.825X1-0.154X2+0.065X3+0.752X4+0.536X5+0.605X6+0.018X7；

(3)

第3主成分：F3=-0.086X1+0.118X2+0.776X3+0.107X4+0.124X5+0.596X6+0.645X7。

(4)

大果山楂發酵液的綜合抗氧化能力值：

F綜合=1.214 2×(0.386 2F1+0.241 2F2+0.196 2F3)。

(5)

2.2 單因素試驗

2.2.1 大果山楂添加量對發酵液抗氧化活性的影響 由圖1可知，發酵前期，大果山楂發酵液的抗氧化活性逐漸提高，尤其是0～21 d，提高的幅度尤為明顯，可能是由于細胞破裂，大果山楂中的主要活性成分不斷溶出造成的，也有可能是由于原本的大分子物質被分解成小分子，從而在檢測結果上顯示出含量增加的現象[19]。發酵后期，這些活性成分含量出現了小幅下降，可能是由于被氧化或被降解造成的。發酵液的抗氧化能力隨大果山楂添加量的增加而增強，這種現象在5～20 g/100 mL發酵液的大果山楂添加量組中比較明顯，但在20～25 g/100 mL發酵液的大果山楂添加量組中不顯著，綜合考慮，擬采用20 g/100 mL發酵液左右的大果山楂添加量進行響應面優化試驗。

圖1 大果山楂添加量對大果山楂發酵液抗氧化活性的影響

2.2.2 LGG接種量對發酵液抗氧化活性的影響 由圖2可知，發酵初期，LGG接種量大的試驗組抗氧化能力值較大，但發酵后期這種差異不明顯，LGG接種量5～9 mL/100 mL 發酵液試驗組的變化曲線基本重合，說明過多的LGG接種量對大果山楂發酵液的抗氧化能力影響有限，因此選擇5 mL/100 mL 發酵液左右的LGG接種量進行響應面優化試驗。

圖2 LGG接種量對大果山楂發酵液抗氧化活性的影響

2.2.3 發酵溫度對發酵液抗氧化活性的影響 由圖3可知，25 ℃和30 ℃試驗組的抗氧化能力值顯著高于其他試驗組，且在第0～28天這兩組的抗氧化能力值變化曲線幾乎重合，28 d之后25 ℃試驗組的抗氧化能力值超過了30 ℃試驗組，因此考慮在25 ℃左右進行響應面優化試驗。

圖3 發酵溫度對大果山楂發酵液抗氧化活性的影響

2.2.4 起始pH對發酵液抗氧化活性的影響 由圖4可知，起始pH 4.0，5.0，6.0試驗組的抗氧化能力值明顯高于其他試驗組，且這3組的抗氧化能力值出現了交替領先的現象，因此考慮在起始pH 5.0左右進行響應面優化試驗。

圖4 起始pH對大果山楂發酵液抗氧化活性的影響

綜合單因素試驗結果，得出了響應面試驗的因素與水平，即大果山楂添加量15～25 g/100 mL發酵液、LGG接種量3～7 mL/100 mL發酵液、起始pH 4.0～6.0、發酵溫度20～30 ℃，各試驗組大果山楂發酵液的抗氧化能力值在第0～28天增速較快，之后增幅逐漸放緩，從工業化生產的效率和效益方面考慮，發酵時間確定為28 d。

2.3 響應面優化試驗

2.3.1 響應面模型的建立 以單因素試驗為依據，設計大果山楂發酵的響應面優化試驗因素與水平，如表5所示。

表5 大果山楂發酵的響應面優化試驗因素水平表

2.3.2 試驗結果及方差分析 大果山楂發酵的響應面優化試驗結果如表6所示。

表6 大果山楂發酵的響應面優化試驗結果

由表7可知，模型的P值<0.000 1，說明回歸性極顯著，結果可信。失擬項P值(0.927 5)>0.05，說明模型的相對誤差較小，能夠較好地預測分析大果山楂發酵工藝。因素A、C和D對結果有顯著性影響，因素B對結果的影響不顯著，各因素對大果山楂發酵液抗氧化能力影響的大小順序為：A>D>C>B。采用Design-Expert 8.0軟件對回歸模型進行預測分析，將大果山楂發酵液抗氧化能力綜合評分的分值設置得盡可能大，得出最佳發酵工藝：起始pH 5.10、LGG接種量5.05 mL/100 mL發酵液、大果山楂添加量20.15 g/100 mL發酵液、發酵溫度29.83 ℃，此時預測的大果山楂發酵液抗氧化能力綜合評分為3.46分。為了方便操作，在起始pH 5. 0、LGG接種量5 mL/100 mL 發酵液、大果山楂添加量20 g/100 mL發酵液、30.0 ℃條件下進行3次驗證實驗，發酵時間均為28 d，所得結果的平均值為3.42分，與理論值3.46分無顯著性差異，表明該預測模型科學可行。

表7 大果山楂發酵的響應面試驗方差分析結果?Table 7 The results of analysis of variance of response surface test of Malus doumeri fruits fermentation

3 結論

(1) 大果山楂發酵液的抗氧化能力評價模型為：F綜合=1.214 2×(0.386 2F1+0.241 2F2+0.196 2F3)，高抗氧化活性大果山楂發酵液的最佳發酵工藝為：起始pH 5.0，發酵溫度30 ℃，大果山楂添加量20 g/100 mL發酵液、鼠李糖乳桿菌接種量5 mL/100 mL發酵液、發酵時間28 d，該工藝所得大果山楂發酵液的F綜合=3.42。

(2) 試驗采用主成分分析法對可能影響大果山楂發酵液抗氧化活性的7項指標進行了分析，構建了大果山楂發酵液抗氧化能力的綜合評價模型，該模型中的3個主成分分別反映了大果山楂發酵液中不同成分對抗氧化能力的貢獻，雖然DPPH·清除率與大果山楂發酵液中的主要活性成分(總黃酮、總酚、總三萜)都有關聯，但其與總黃酮、總三萜含量的關聯度更高，說明僅用DPPH·清除率作為評價指標無法準確地反映大果山楂發酵液中總酚及其他成分對總抗氧化能力的貢獻。

(3) 大果山楂發酵液中的活性物質含量決定其抗氧化能力，試驗測定的是總黃酮、總酚和總三萜3類物質的含量，但具體是這3類物質中的哪些化合物對大果山楂發酵液的抗氧化能力起主導作用，目前還不清楚，后續計劃通過HPLC法鑒定大果山楂發酵液中的各種化合物，明確各活性物質對其抗氧化能力的具體影響。