4-羥基苯乙酸對M1型巨噬細胞極化及巨噬細胞泡沫化的影響

楊宇哲 李桐云 李 武 楊瑞麗

(1. 華南農業大學食品學院，廣東 廣州 510642; 2. 海南大學食品科學與工程學院，海南 ?？?570228)

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS) 是心腦血管疾病的重要病程之一，慢性炎癥及膽固醇代謝異常是動脈粥樣硬化最危險的因素[1-2]。巨噬細胞是一類具有高度異質性的細胞群，在促炎的微環境下，巨噬細胞極化成M1型，顯著上調腫瘤壞死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β和IL-6等細胞因子的基因表達和分泌量，促進炎癥及動脈粥樣硬化的發生和發展[3-5]。此外，巨噬細胞轉化為泡沫細胞是動脈粥樣硬化發展過程中的關鍵性步驟[6]，而這主要與細胞內脂質代謝異常密切相關。研究[7]發現，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL) 等膽固醇經白細胞分化抗原36(CD36)攝取，在巨噬細胞內轉變成膽固醇酯并大量蓄積，巨噬細胞轉化為泡沫細胞。三磷酸腺苷結合盒轉運體A1(ABCA1)、三磷酸腺苷結合盒轉運體G1(ABCG1)等膜轉運蛋白介導巨噬細胞內游離膽固醇流出[8-9]，維持細胞內膽固醇平衡，進而抑制泡沫細胞形成。抑制M1型巨噬細胞的大量聚集和泡沫細胞的形成，對于預防AS的發生和發展具有重要意義。

多酚類物質具有抗氧化、降血脂、改善心腦血管疾病等活性[10-11]，但是多酚的生物利用率極低，超過95%的膳食多酚不能被小腸吸收[12-13]，而通過結腸微生物代謝轉化成其他小分子物質再吸收進入人體發揮生物活性作用，例如鞣花酸和鞣花單寧被腸道菌群轉化生成的尿石素類物質[14]，大豆異黃酮被腸道菌群轉化生成雌馬酚[15]。已有研究證明，4-羥基苯乙酸(4-hydroxyphenylacetic acid，4-HPAA)是原花青素、山奈酚等多酚類物質的主要腸道菌群代謝物[16-18]，且4-HPAA能提高小鼠抗氧化酶和肝臟Ⅱ相代謝酶活力進而預防肝損傷[19]。目前，尚未見4-HPAA對M1型巨噬細胞極化以及對巨噬細胞泡沫樣化的研究報道。試驗擬探究4-HPPA對M1型巨噬細胞極化過程的作用，并初步研究其對巨噬—泡沫細胞形成的影響，從而探討多酚腸道菌群代謝物4-HHPA抗動脈硬化的作用，以期為多酚預防和改善動脈粥樣硬化作用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

RAW264.7小鼠巨噬細胞系：廣州中醫藥大學；

4-羥基苯乙酸、脂多糖、干擾素：美國Sigma公司；

氧化低密度脂蛋白：廣州弈元生物技術有限公司；

油紅O：美國Gibico公司；

TNF-α、IL-6 和IL-1βELISA試劑盒：美國R&D System公司；

總膽固醇、游離膽固醇試劑盒：北京普利萊生物技術有限公司；

DMEM培養基：美國Gibico公司；

細胞總RNA提取試劑盒、Synthesis Super Mix for q PCR、Trans Start Tip Green q PCR Super Mix：北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2 主要儀器設備

多功能酶標儀：MultiskanMk3型，美國ThermoFisher公司；

熒光定量PCR儀：CFX96型，美國Bio Rad公司；

CO2細胞培養箱：TC-2323型，美國Shldon公司；

光學顯微鏡：IX71型，日本Olympus公司。

1.2 方法

1.2.1 4-羥基苯乙酸對RAW264.7細胞活力的影響 采用CCK-8法。收集對數生長期的 RAW264.7細胞并制成細胞懸液，調整細胞密度為5×104mL-1，以100 μL/孔接種于96孔板，待細胞完全貼壁后，棄去培養液。細胞分為空白組(0.1% DMSO無血清培養液)，不含細胞的培養液為對照組，以及6.25，12.50，25.00，50.00 μg/mL 4-HPAA 的試驗組，每組設置4個復孔，繼續培養24 h后，分別加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育1 h。于微量振蕩器上振蕩5 min，用酶聯免疫檢測儀檢測各孔OD450 nm值，記錄數值。按式(1)計算細胞存活的百分數。

(1)

式中：

C——細胞存活率，%；

A1——試驗組吸光度；

A0——空白組吸光度；

A2——對照組吸光度。

1.2.2 RAW264.7細胞M1極化模型的建立與試驗分組

將對數生長期的RAW264.7以 1×105個/mL接種于6孔板中，待細胞密度達到35%～50%時分為以下3組：空白對照組加入無血清培養液；模型組加入LPS(100 ng/mL)和 IFN-γ(20 ng/mL)，誘導M1型巨噬細胞的形成；干預組加入LPS(100 ng/mL)和 IFN-γ(20 ng/mL)，同時加入終質量濃度為6.25或12.50 μg/mL 的4-HPAA干預，于37 ℃，5% CO2的培養箱中孵育24 h后進行后續檢測。

1.2.3 巨噬細胞源性泡沫細胞模型的建立與試驗分組

收集對數生長期的RAW264.7細胞，制成細胞懸液，調整細胞密度為5×106mL-1，以2 mL/孔接種于放有無菌細胞爬片的6孔板中。待細胞完全貼壁后，棄去培養液，用無血清培養基饑餓培養24 h后分為以下3組：對照組加入無血清培養液；模型組加入80 μg/mL的ox-LDL，誘導細胞攝入脂質形成泡沫細胞；干預組加入80 μg/mL的ox-LDL，同時加入終質量濃度為6.25或12.50 μg/mL的4-HPAA干預，孵育24 h后進行后續檢測。

1.2.4 炎癥因子的分泌檢測 采用ELISA法。干預結束后收集細胞上清液，5 000 r/min離心20 min，吸取上清液，使用相應的ELISA檢測試劑盒檢測TNF-α、IL-6和IL-1β蛋白的水平。

1.2.5 油紅O染色 將細胞接種于鋪有蓋玻片的6孔板中，給藥24 h后，移除培養基，PBS 沖洗3次，10%甲醛溶液固定3 h，PBS清洗一次，60%異丙醇放置30 s。吸去異丙醇溶液，加入2 mL 0.5%油紅O異丙醇溶液并于60 ℃烘箱中染色30 min。60%異丙醇清洗30 s，蒸餾水清洗3次。蘇木素染色5 min，蒸餾水洗5 min。1%鹽酸—乙醇分色30 s，PBS返藍10～15 min。用10 μL 50%甘油水溶液封片，光學顯微鏡下觀察。

1.2.6 巨噬細胞源性泡沫細胞膽固醇酯含量的測定 棄去培養液的細胞用PBS清洗2遍，每孔加入100 μL 1% TritonX-100裂解液，4 ℃裂解30 min，參照試劑盒步驟測定總膽固醇和游離膽固醇含量，膽固醇酯含量為總膽固醇和游離膽固醇的差值。采用BCA試劑盒測定細胞內蛋白含量。

1.2.7 基因表達水平測定 RAW264.7巨噬細胞按1.2.2和1.2.3造模和分組作用24 h后，傾去培養液，用預冷的PBS洗3次，Trizol試劑提取細胞總RNA，用Takara逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應cDNA，并采用實時熒光定量PCR儀檢測基因(IL-6、TNF-α、IL-1β、ABCA1、ABCG1和CD36)的表達量。實時熒光定量PCR條件為95.0 ℃預變性5 min；95.0 ℃變性30 s，60.0 ℃ 退火30 s，72.0 ℃延伸1 min，30個循環，每個循環結束前系統自動檢測熒光產物的量，所有循環結束后，繪制溶解曲線以判斷擴增產物的特異性。以β-actin作為內參，采用2-ΔΔCt法分析基因的相對表達量。引物由廣州銳博生物科技公司設計并合成(見表1)。

表1 RT-PCR檢測引物Table 1 Primer name and sequence

1.3 數據分析

結果以mean±SD表示(n=4)。采用SPSS 22.0軟件，單因素分析方法(ANOVA)進行顯著性分析，字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 4-HPAA對RAW264.7細胞活力的影響

由圖1可知，當4-HPAA和細胞共同培養24 h時，濃度為6.25～100.00 μg/mL的4-HPAA對細胞活性無顯著影響，巨噬細胞存活率均在95%以上。

圖1 4-HPAA對細胞活力的影響Figure 1 Effect of 4-HPAA on RAW264.7 viability

2.2 4-HPAA對M1型極化巨噬細胞分泌炎癥細胞因子的影響

巨噬細胞向M1型極化后會分泌大量炎癥細胞因子。由表2可知，與對照組相比，M1型極化巨噬細胞模型組炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌量均顯著升高(P<0.05)，表明M1型極化模型建立成功。與模型組相比，4-HPAA顯著降低了炎癥細胞因子的分泌水平(P<0.05)，其中當濃度為12.50 μg/mL時，4-HPAA組的TNF-α、IL-6和IL-1β分泌量分別降低為M1型極化巨噬細胞模型組的60.78%，38.03%，39.35%(P<0.05)。原花青素[20]、山奈酚[21]、榴蓮殼多酚[22]等多酚類化合物具有抗炎癥作用，其腸道菌群代謝物4-HPAA可能在其中發揮了重要作用。

表2 4-HPAA對 M1型極化巨噬細胞分泌的炎癥因子的影響

2.3 4-HPAA對M1型極化巨噬細胞相關標志基因表達的影響

由圖2可知，與空白組相比，M1型極化巨噬細胞模型組的TNF-α、IL-6和IL-1β3種極化相關標志基因mRNA的表達量顯著升高(P<0.05)；加入4-羥基苯乙酸干預后，與M1型極化組相比，TNF-α、IL-6和IL-1βmRNA的表達量均顯著降低(P<0.05)，其降低程度與4-HPAA 濃度呈正相關。說明4-HPAA干預后可抑制LPS和IFN-γ誘導的巨噬細胞向M1型極化。韓淇安等[23]發現鞣花酸的腸道菌群代謝產物尿石素A能抑制LPS誘導的巨噬細胞向M1型極化。表明腸道菌群代謝物抑制巨噬細胞向促炎的M1型極化可能在多酚預防和改善動脈粥樣硬化發生發展的過程中起到了重要作用。

圖2 4-HPAA對M1型極化巨噬細胞相關標志基因表達的影響Figure 2 Effect of 4-HPAA on M1 macrophage signature gene expression

2.4 4-HPAA對RAW264.7細胞內脂質蓄積的影響

由圖3可知，對照組細胞內未見染紅的脂滴，巨噬細胞被80 μg/mL的ox-LDL孵育24 h后，細胞數量減少，胞體內有大量的脂滴排列在細胞膜內側，有少量細胞破裂且脂滴外溢，細胞泡沫化現象嚴重。與泡沫細胞模型組比較，不同濃度的4-HPAA干預均能顯著降低細胞染紅程度，高濃度組抑制細胞內脂質蓄積的效果顯著高于低濃度組。原花青素[24]、山奈酚[25]、石榴皮多酚[26]等多酚類化合物具有抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞脂質蓄積的作用，改善脂質代謝異常是多酚防治動脈粥樣硬化的機制之一。

1. 對照組 2. ox-LDL泡沫細胞模型組 3. ox-LDL+6.25 μg/mL 4-HPAA組 4. ox-LDL+12.50 μg/mL 4-HPAA 組

2.5 4-HPAA對RAW264.7細胞膽固醇含量的影響

由圖4可知，與對照組相比，80 μg/mL的ox-LDL處理巨噬細胞24 h后，巨噬細胞內膽固醇酯含量顯著升高(P<0.05)；與空白對照組相比，泡沫細胞模型組膽固醇酯含量顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，4-HPAA顯著降低了巨噬細胞內膽固醇酯含量，且隨著4-HPAA濃度的增加，其降低作用更明顯(P<0.05)，其中12.50 μg/mL 4-HPAA組的膽固醇酯含量降低至泡沫細胞模型組47.30%。與模型組相比，4-HPAA組細胞內游離膽固醇含量有所降低，但無顯著性差異，表明巨噬細胞源性泡沫細胞中聚集的脂質以膽固醇酯為主，當膽固醇酯含量超過50%時，巨噬細胞成為泡沫細胞[27]，4-HPAA主要通過降低細胞內膽固醇酯的聚集進而抑制泡沫細胞的形成。

圖4 4-HPAA對ox-LDL誘導的巨噬細胞膽固醇含量的影響

2.6 4-HPAA對RAW264.7細胞膽固醇代謝相關基因表達的影響

由圖5可知，各組ABCA1表達無顯著變化，與泡沫細胞模型組相比，4-HPAA顯著上調ABCG1基因表達水平，顯著下調CD36基因表達水平。4-羥基苯乙酸通過下調巨噬細胞的CD36和上調ABCG1基因表達，降低細胞內膽固醇攝入并增加膽固醇的流出，減少巨噬細胞內脂質的蓄積，抑制巨噬細胞向泡沫細胞的轉化[28]。石榴皮等多酚提取物[29]通過提高ABCA1和/或ABCG1的表達引起的膽固醇流出增加，進而抑制ox-LDL誘導的巨噬細胞泡沫化。

圖5 4-HPAA對巨噬—泡沫細胞膽固醇轉運相關基因表達的影響

3 結論

試驗以多酚腸道菌群代謝物4-羥基苯乙酸為對象，探討其對M1型巨噬細胞極化及巨噬細胞泡沫化的影響及相關機制。結果表明，4-羥基苯乙酸通過下調M1型巨噬細胞標志基因TNF-α、IL-6和IL-1β的表達，降低炎癥細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的分泌，抑制RAW264.7小鼠巨噬細胞向促炎的M1型巨噬細胞極化；油紅O染色發現4-HPAA能顯著抑制ox-LDL誘導巨噬—泡沫細胞形成，并顯著降低膽固醇酯含量(P<0.05)；實時熒光定量聚合酶鏈式反應檢測表明4-HPAA能顯著上調三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白G1、下調CD36基因的表達。說明4-羥基苯乙酸能抑制巨噬細胞向M1型極化，同時能夠抑制巨噬—泡沫細胞形成。由于多酚具有相對較低的生物利用度，說明其腸道菌群代謝物可能在其改善動脈粥樣硬化的過程中發揮著重要的作用，腸道菌群代謝物4-羥基苯乙酸的生物利用度、效應部位和分子機制等還有待于進一步研究。