腹瀉型腸易激綜合征大鼠腸道樹突細胞對Th1/Th2免疫平衡以及內臟高敏感的影響*

莊肇朦 謝 敏 張益光 呂 賓

溫州市中西醫結合醫院消化內科1(325000) 浙江中醫藥大學附屬第一醫院消化內科2

背景：腸易激綜合征(IBS)的發病原因和機制尚未完全明確，臨床上缺乏有效的預防和診治手段。近年越來越多的研究認為腸道局部黏膜免疫功能異常在IBS發病中起有重要作用。目的：探討腸道樹突細胞(DC)在腹瀉型IBS(IBS-D)大鼠結腸黏膜Th1/Th2免疫應答途徑失衡中的作用及其對內臟高敏感的影響。方法：將45只成年SD大鼠隨機分為空白對照組、NS對照組和模型組，每組各15只。以乙酸灌腸聯合束縛應激制備大鼠內臟高敏感模型，以腹壁回撤反射(AWR)實驗和大鼠糞便性狀評估內臟敏感性。采用流式細胞分選技術分離經相應特異性抗體標記的腸系膜淋巴結DC以及脾臟初始CD4+T細胞并體外進行共培養，以MTT法檢測CD4+T細胞的增殖能力，ELISA法檢測Th1途徑細胞因子IL-12、IFN-γ和Th2途徑細胞因子IL-4、IL-9的分泌能力。結果：與NS對照組和空白對照組相比，模型組大鼠內臟敏感性明顯增高(P<0.05)，腸道淋巴結來源的DC促進脾臟CD4+T細胞增殖的能力增強(P<0.05)，IL-4和IL-9分泌量明顯升高(P<0.05)，IL-12分泌量明顯減少(P<0.05)。結論：IBS-D內臟高敏感大鼠腸道DC的抗原呈遞能力增強，誘導Th2途徑免疫應答能力亢進，進而導致局部腸道黏膜Th1/Th2免疫應答途徑失衡。

腸易激綜合征(IBS)的發病原因和發病機制尚未完全明確，近年越來越多的研究認為腸道和全身免疫應答的失調以及免疫調節功能異常與IBS發病密切相關，其中腸道局部黏膜免疫功能異常在IBS發病中起有重要作用。

抗原呈遞細胞(antigen presenting cells, APC)在腸黏膜免疫功能方面發揮關鍵作用[1]。樹突細胞(dendritic cell, DC)屬APC，具有強大的誘導T細胞初次免疫應答的能力，是誘導初始T細胞(Th0細胞)活化的主要APC[2]。有研究[3-4]發現腹瀉型IBS(IBS-D)大鼠和患者結腸黏膜組織中DC數量增多，CD4+Th2免疫應答途徑相關細胞因子分泌增多，肥大細胞過度活化脫顆粒，且與后期的內臟高敏感癥狀持續時間、腸道繼發性感染風險相關。本研究通過觀察IBS-D大鼠腸黏膜CD4+T細胞Th1/Th2途徑免疫應答失衡的現象，旨在探討DC對IBS-D大鼠內臟高敏感和Th1/Th2免疫平衡的影響。

材料與方法

一、實驗動物

45只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由第三軍醫大動物醫學中心提供，無畸形，無外傷，皮膚無感染，體質量(250±10)g，常規飼養，適應性飼養一周。環境設置：室溫22～24 ℃，濕度<60%，噪音<50 db。

二、主要儀器與試劑

IgG isotype matehed antibodies、CD4熒光抗體(美國eBioscience公司)，MHCⅡ、CD11b、CD80、CD86熒光抗體(美國BD公司)；流式細胞檢測儀(FACSVantage SE)，每100個細胞中加入80 μL緩沖液和20 μL 抗CD4熒光抗體，每110個細胞中加入80 μL緩沖液和25 μL 抗CD11b熒光抗體，調節流式細胞儀使目標細胞通過樣品室的濃度為100～300個/s；8F導尿管(直徑2 mm，球囊最大容量3 mL，最大直徑2 cm)，用于結直腸內球囊擴張導管(浙江康康醫療器械有限公司生產)；冰乙酸、MTT(北京康為世紀生物科技有限公司)；IL-12、IL-4 ELISA試劑盒(美國eBioscience公司)；IFN-γ、IL-9 ELISA試劑盒(Cusabio公司)。

三、研究方法

1.實驗分組和模型建立：采用隨機數字表法將大鼠隨機分為空白對照組、0.9% NaCl溶液對照組(NS對照組)和模型組，每組各15只。模型組采用乙酸灌腸聯合束縛應激建立內臟高敏感模型[5-6]；NS對照組給予相應0.9% NaCl溶液灌腸處理；空白對照組不予處理。

2.內臟敏感性評估：實驗第10天，以大鼠在下午2～5時之間的排便情況以及結直腸擴張時腹壁回撤反射(AWR)評分為3分時所需的氣囊壓力作為評價內臟敏感性的指標[7]。

3.標本采集：于乙酸灌腸后第2天隨機選取空白對照組和模型組大鼠各2只，給予3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后取距離肛門6 cm處的結腸組織1 cm。在模型建立成功后的實驗第10天，各組大鼠經3%戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后處死，70%乙醇浸泡10 min，無菌條件下剖開大鼠腹腔取脾臟和腸系膜淋巴結，碾磨后收集細胞懸液。

4.HE染色：取距肛門6 cm處的結腸組織，多聚甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，連續切片，行HE染色，觀察大鼠黏膜損傷修復情況。

5.流式細胞術：調整細胞濃度為8×106～10×106/mL，用熒光標記目標抗體染色細胞，過濾，將濾液移入流式管，上流式細胞儀進行分選，離心濃縮，重懸，培養，從腸系膜淋巴結細胞中篩選出DC，從脾臟淋巴細胞中篩選出CD4+T細胞。

6.MTT法：將分離得到的DC調整濃度至5×105/mL，與1.5×106/mL CD4+或CD8+T細胞共培養，收集上清液，使用MTT法檢測DC促進CD4+T細胞增殖的效果。

7.ELISA法：將分離得到的DC調整濃度至5×105/mL，與1.5×106/mL CD4+或CD8+T細胞共培養，仔細收集上清液，嚴格根據ELISA試劑盒說明書要求，檢測Th1途徑細胞因子IL-12、IFN-γ以及Th2途徑細胞因子IL-4、IL-9的分泌能力。

四、統計學分析

結 果

一、一般情況

造模后，三組大鼠在第1～2天均表現出焦躁不安，大便稀水樣，肛周污染，有糞便殘留，飲水增多，進食量明顯減少。第4～5天開始，空白對照組和NS對照組大鼠糞便水分減少，以軟便為主，偶可見稀便；模型組大鼠糞便水分亦較前減少，排便量和稀便發生率較其余兩組多見。第7天開始行束縛應激時，空白對照組和NS對照組大鼠糞便以軟便為主，偶可見顆粒樣糞便，無稀便；模型組大鼠以軟便為主，偶可見顆粒樣糞便和稀便，排便量較其余兩組增加。在乙酸灌腸聯合束縛應激實驗完成后，NS對照組大鼠偶可見解稀便，肛周毛發糞便殘留，伴易激怒，聳毛現象；空白對照組大鼠肛周毛發清潔度良好，無明顯糞便污染，兩組大鼠進食量和飲水量未見明顯異常，活動量無特殊改變，體質量處于正常增長范圍；模型組大鼠出現反應遲鈍，易激怒，聳毛，解稀便，軟便，肛周毛發糞便污染殘留，進食量和飲水量減少，活動明顯減少，體質量下降等表現。肉眼觀察和HE染色均未見大鼠結腸黏膜存在糜爛和潰瘍性病變。實驗第10天，模型組大鼠軟便數和總便數明顯高于NS對照組和空白對照組(P<0.05；表1)。

表1 三組大鼠排便情況差異(實驗第10天14時-17時排便情況)(n)

二、內臟敏感性

AWR評分為3分時，模型組大鼠結直腸球囊擴張的壓力明顯低于空白對照組和NS對照組(P<0.05)，而空白對照組與NS對照組相比差異無統計學意義(P>0.05;表2)。說明模型組內臟敏感性明顯增高。

三、DC和脾臟CD4+T細胞分離結果

1.分離細胞表型測定結果：流式細胞術檢測顯示CD4+T細胞陽性率為92.46%±6.87%，臺盼藍染色顯示細胞活性>90%；DC由PE標記OX62后流式分選所得，陽性率為97.46%±1.87%，臺盼藍染色顯示細胞活性>90%。

2.分離DC細胞預培養：流式分選后所獲取的DC在體外常規培養后可見細胞表面典型樹枝狀凸起(圖1)。

圖1 流式分選所得DC和CD4+T細胞(箭頭所示為DC，其余為CD4+T細胞)

四、DC和脾臟CD4+T細胞共培養結果

1.DC促進CD4+T細胞增殖效果：模型組CD4+T細胞的增殖能力顯著高于NS對照組和空白對照組(P<0.05)，而后兩組之間相比無明顯差異(表2)。說明模型組DC促進CD4+T細胞增殖的作用增強。

2.DC促CD4+Th0細胞分泌細胞因子的情況：當DC與CD4+Th0細胞共培養時，模型組IL-4、IL-9分泌顯著高于NS對照組和空白對照組，IL-12分泌顯著減少(P<0.05)，而NS對照組與空白對照組之間無明顯差異。三組IFN-γ分泌水平無明顯差異，可能與實驗結果不穩定存在一定關系(表2)。

表2 三組大鼠內臟敏感性、CD4+T細胞增殖和細胞因子比較

討 論

近年來相關研究發現腸道黏膜免疫功能異常對IBS-D的發病和內臟高敏感的嚴重程度起有重要作用。IBS患者結腸黏膜中免疫細胞(DC、肥大細胞、CD4+T細胞)數量增多，同時伴有相應細胞因子(IL-4、IL-6、IL-9、TNF-α等)表達增加[1,8]。前期實驗亦發現IBS-D患者和大鼠血清、腸道黏膜DC數量明顯增多，黏膜肥大細胞浸潤增加，且其活化脫顆粒增強，同時伴有CD4+T細胞Th2免疫應答途徑相關細胞因子IL-4、IL-9分泌明顯增加等現象[9]。然而IBS-D大鼠腸黏膜CD4+T細胞Th1/Th2途徑免疫應答失衡現象及其與腸道DC之間的關系，以及對IBS-D大鼠內臟高敏感的影響尚需行進一步實驗闡明。

APC在腸道黏膜免疫應答中起有關鍵作用。在異常情況下，APC對抗原的敏感性增加，引起腸黏膜免疫反應的異常激活和持續應答[10]，從而在IBS的發病中起有重要作用。DC廣泛分布于黏膜固有層、腸道Peyer淋巴結、腸系膜淋巴結以及全身血液、其他組織器官中，具有誘導Th0細胞活化的功能[2]，故在全身和黏膜免疫應答過程中起極其重要的作用。DC通過向Th0細胞提供活化的第一、第二信號，誘導其向Th1和Th2亞群分化。在此過程中分別產生相應的細胞因子輔助免疫應答，包括Th1途徑的IL-2、IL-12、IFN-γ以及Th2途徑的IL-4、IL-9。

Th1免疫反應表現為IFN-γ、IL-2和淋巴毒素-α分泌的增加，參與細胞免疫，可抵御細胞內病原體如病毒、細菌、原蟲、真菌等[2]。Th2免疫反應表現為IL-4分泌增加，輔助B細胞的激活和增殖，參與體液免疫，或促進B細胞分泌大量IgE參與變態反應，在抵御細胞外病原體的過程中起主要作用。在正常機體內，當外來病原體(如寄生蟲、細菌、病毒等)入侵腸道時，腸黏膜固有層的免疫細胞和細胞因子通過Th1途徑和Th2途徑相輔相成，共同維持腸道黏膜免疫環境的穩定，但Th1/Th2比例失衡時，容易誘發黏膜免疫功能的紊亂，從而導致疾病的發生[11]。

Long等[12]的研究發現感染后腸易激綜合征小鼠腸道固有層DC在急性期與脾臟Th0細胞共培養后可產生Th2途徑免疫應答，然而其未對IBS-D模型動物腸道Th1/Th2途徑免疫應答失衡現象行進一步研究和探討。

結合前期研究結果，本研究發現模型組大鼠經提取的成熟DC促進自體初始CD4+T細胞增殖的能力增強，兩者共培養時Th2途徑細胞因子IL-4和IL-9分泌量較NS對照組和空白對照組明顯增多，而Th1途徑細胞因子IL-12分泌量較兩組對照組減少。提示IBS-D大鼠腸道DC可能通過亢進的抗原呈遞能力，介導脾臟CD4+Th0細胞活化，誘導Th0細胞向Th2細胞分化，從而導致黏膜Th2免疫應答占絕對優勢，Th1/Th2免疫應答途徑失衡，產生明顯多于生理量的細胞因子IL-4、IL-9。

腸黏膜肥大細胞浸潤，活化、脫顆粒，以及相應介質的釋放是IBS-D患者產生內臟高敏感的主要機制之一[13-14]。Th1/Th2免疫應答途徑失衡，分泌亢進的細胞因子IL-4、IL-9通過作用于肥大細胞在IBS-D的發病過程中扮演重要角色。IL-4是特異性促IgE生成的細胞因子，與肥大細胞的活化密切相關[15-16]。IL-9能增加肥大細胞表面FceRIα的表達，使肥大細胞處于更易被激活的狀態[17-18]。因此，細胞因子可能作為T細胞與肥大細胞之間的媒介，介導黏膜異常免疫應答的發生。

綜上所述，本研究發現IBS-D內臟高敏感大鼠腸道黏膜DC數量增多，抗原呈遞功能亢進，從而促進自體CD4+T細胞過度增殖，并誘導Th0細胞主要向Th2細胞亞型分化，從而導致黏膜Th2免疫應答占絕對優勢，Th1/Th2免疫應答途徑失衡，產生大量細胞因子IL-4、IL-9。進一步引發了后續肥大細胞過度增殖、活化、脫顆粒的現象，從而導致內臟高敏感的發生。

同時，IBS-D大鼠腸道黏膜Th2免疫反應異常亢進，使腸道黏膜抗外來病原體感染免疫過度應答，黏膜維穩修復功能可能下降。因此，Th1/Th2免疫平衡紊亂為IBS-D大鼠繼發腸道感染性疾病提供了免疫學基礎。未來將對IBS-D大鼠腸黏膜Th1/Th2免疫應答途徑失衡所造成的抗病原微生物感染免疫失調現象行進一步實驗，通過觀察正常大鼠、IBS-D大鼠與IBS-D繼發腸道感染大鼠腸道黏膜免疫細胞功能和數量以及相應細胞因子的分泌量、各組大鼠內臟敏感性等指標，進一步明確IBS-D大鼠在黏膜Th1/Th2免疫應答途徑失衡基礎上所面臨的繼發腸道大腸埃希菌感染高風險，以及繼發感染后進一步加重的免疫應答紊亂現象，從而深入研究IBS患者繼發腸道大腸埃希菌感染性疾病的風險以及對內臟高敏感癥狀的影響。