依托咪酯通過調節Hippo信號通路抑制鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移

陳明明，李克寒，劉相樂，姚晶，馬慧穎

(1.河南科技大學第一附屬醫院麻醉科，河南 洛陽 471000； 2.洛陽市第三人民醫院麻醉科，河南 洛陽 471000)

鼻咽癌是最常見的頭頸部腫瘤之一，是一種發生于鼻咽腔頂部和側壁的惡性腫瘤。由于其區域分布和家族聚集，主要在中國南部和東南亞國家流行[1]。由于鼻咽區域中復雜的解剖結構，在這種類型的癌癥中很少進行手術，并且化學療法受到各種嚴重副作用的限制[2]。近年來癌癥治療手段取得不少進步，但鼻咽癌患者的5年生存率仍然徘徊在50%～70%[3]。因此，迫切需要開發能夠治療鼻咽癌的新藥物。先前的研究表明，一些麻醉劑不僅通過阻斷圍手術期應激反應，而且還通過誘導抗癌效應來抑制癌癥轉移[4]。依托咪酯是一種催眠性靜脈全麻藥，是咪唑類衍生物，由于其安全性高，是麻醉誘導常用的藥物之一。已有研究表明，依托咪酯抑制A549肺腺癌細胞的侵襲和遷移[5]，但依托咪酯對鼻咽癌的作用尚不清楚。Hippo信號通路是一個調節器官大小、組織再生和癌癥的關鍵信號通路，已有研究證明Hippo通路參與鼻咽癌細胞上皮間質轉化[6]。本文主要研究依托咪酯通過調節Hippo信號通路對鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑

順鉑(浙江聯碩生物科技有限公司，批號：PHR1624)，依托咪酯(HPLC≥99%，上海麥克林生物技術股份有限公司，批號：33125-97-2)，RPMI-1640培養液(上海栩冉生物科技有限公司，批號：C22400500BT)，胎牛血清(素爾生物科技有限公司，批號：16000-044)，MTT試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司，批號：ZY111105)，RIPA裂解緩沖液(南京海克爾生物科技有限公司，批號：SBJ-0999)，BCA試劑盒(上海易色醫療科技有限公司，批號：BC201)，辣根過氧化物酶標記的二抗、SGK3抗體、MST抗體、p-MST抗體、LAST抗體、p-LAST抗體、YAP抗體、p-YAP抗體(上海艾博抗生物科技有限公司，批號： ab6728、ab126108、ab85377、ab79199、ab70561、ab111344、ab205270、ab76252),Transwell小室(北京優尼康生物科技有限公司，批號：3422)，XMU-MP-1(Selleckchem，批號#S8334,)。

1.2 細胞培養

鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1購自上海復祥生物科技有限公司。鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1細胞在37 ℃、體積分數為5%CO2條件下，于含有體積分數為10% 胎牛血清的RPMI-1640培養基中培養。

1.3 MTT法檢測細胞活性

在96孔板中，將鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞分別用不同濃度(0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)處理12 h、24 h、48 h時，再用10 μL MTT染料處理細胞，然后與100 μL二甲基亞砜孵育15 min，用酶免疫分析儀在490 nm處測量吸光度。用各濃度處理組細胞吸光值與0 μmol/L組細胞的吸光度表示細胞活性。

1.4 分組及處理

將鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞分別分為對照組、依托咪酯低劑量組、依托咪酯中劑量組、依托咪酯高劑量組、順鉑組、Hippo通路抑制劑(XMU-MP-1)組、依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組。對照組、依托咪酯低、中、高劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞用終濃度含有依托咪酯 0、10、20、40 μg/mL培養基培養；順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞用終濃度含有Cisplatin 10 μg/mL培養基培養；Hippo通路抑制劑組和依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1用終濃度含有XMU-MP-1 10 μg/mL和依托咪酯 0、40 μg/mL培養基培養。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

將各組轉染的鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞以1×106細胞/孔的密度接種在12孔板中，鋪滿單層后，用小號槍頭垂直在孔中間劃痕。在CO2體積分數為5%、37 ℃恒溫的培養箱培養24 h后。在劃痕0 h和24 h拍攝的圖像，使用ImageJ評估細胞遷移能力。細胞遷移率(%)=(0 h時的劃痕面積-24 h時的劃痕面積)/0 h的劃痕面積×100%。

1.6 Transwell實驗檢測細胞侵襲

在 Transwell 小室中鋪 40 μL matrigel 基質膠，在細胞培養箱中使其凝固，然后在Transwell小室上室接種鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞懸浮液和不含血清的培養基，終濃度為 2.5×105個/mL，并在Transwell小室下室加入含血清和絲裂霉素C的培養基，培養24 h后，取出Transwell 小室，用結晶紫染色，并在顯微鏡下觀察分析。

1.7 蛋白質印跡分析檢測p-MST、p-LATS、p-YAP、MST、LATS、YAP蛋白表達水平

在裂解緩沖液中提取總蛋白質，并用BCA測定試劑盒測量蛋白質濃度。將10 μg 蛋白樣品用10% SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜上。 用5%脫脂奶粉封閉膜，然后用一抗(p-MST 1∶500、p-LATS 1∶500、p-YAP 1∶10 000、MST1∶100、LATS 1∶5000、YAP 1∶1000)在4 ℃封閉過夜，接著加入對應辣根過氧化物酶偶聯的二抗室溫孵育1 h，最后滴ECL曝光)，然后再次用TBST洗滌3次。 使用ECL系統檢測結合的抗體。

1.8 統計學方法

2 結果

2.1 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞存活率的影響

隨著依托咪酯濃度的增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞活性明顯下降；隨著培養時間增加，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞活性逐漸下降。當依托咪酯濃度為 5、10、20、40 μg/mL時，鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞活性>80%，毒性較低。因此，本研究選擇依托咪酯10、20、40 μg/mL作后續研究。當濃度相同時，24 h和48 h與12 h比較，差異具有統計學意義(P<0.05)；而24 h 和48 h之間比較無明顯差異，因此，選擇藥物作用時間24 h作后續實驗。見圖1。

2.2 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移的影響

與對照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率有所減少(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率明顯減少(P<0.01)。見圖2。

2.3 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲的影響

與對照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數目無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數目有所減少(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數目明顯減少(P<0.01)。見圖3。

2.4 依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞Hippo信號通路的影響

與對照組相比，依托咪酯低劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達無明顯差異，依托咪酯中劑量組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達有所上調(P<0.05)，依托咪酯高劑量組和順鉑組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達明顯上調(P<0.01)。見圖4。

A. MTT法檢測鼻咽癌CNE-1細胞活性； B. MTT法檢測鼻咽癌HNE-1細胞活性。

A.劃痕實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞遷移; B.劃痕實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞遷移; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

A. Transwell實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞侵襲; B. Transwell實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞侵襲; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

2.5 XMU-MP-1對依托咪酯激活Hippo信號通路的影響

與對照組相比，XMU-MP-1組p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達明顯下調(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達明顯下調(P<0.01)；見圖5。

2.6 XMU-MP-1對依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移的影響

與對照組相比，在XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率明顯增加(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，在依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞遷移率明顯增加(P<0.01)。見圖6。

2.7 XMU-MP-1對依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲的影響

與對照組相比，在XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數目明顯增加(P<0.05)；與依托咪酯高劑量組相比，在依托咪酯高劑量+XMU-MP-1組鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞侵襲細胞數目明顯增加(P<0.01)。見圖7。

3 討論

鼻咽癌是最具侵襲性的頭頸部鱗狀細胞癌之一，經常轉移到遠處的淋巴結和器官。由于鼻咽癌致死率高，治療后生活質量低，且鼻咽癌復發率高，所以該病的治療仍是一個具有挑戰性的臨床問題[7]。順鉑是一種鉑類抗腫瘤化療藥物，用于治療包括鼻咽癌在內的多種實體惡性腫瘤。雖然具有較高的初始響應性，但多數鼻咽癌患者不久就會出現獲得性耐藥，最終導致復發或轉移。麻醉劑可通過誘導抗癌效應來抑制癌癥轉移[8]。依托咪酯減少心血管副作用并能夠維持麻醉期間的血流動力學的穩定性，是臨床上理想的鎮靜和麻醉藥。

A.蛋白印跡法檢測鼻咽癌CNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; B.蛋白印跡法檢測鼻咽癌HNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01。

A.蛋白印跡法檢測鼻咽癌CNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; B.蛋白印跡法檢測鼻咽癌HNE-1細胞Hippo信號通路相關蛋白表達水平; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

A.劃痕實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞遷移; B.劃痕實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞遷移; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

A. Transwell實驗檢測鼻咽癌CNE-1細胞侵襲; B. Transwell實驗檢測鼻咽癌HNE-1細胞侵襲; 與對照組比較：*P<0.05，**P<0.01; 與依托咪酯高劑量組比較：##P<0.01。

臨床發現長期應用依托咪酯會引起免疫抑制作用以及增加細胞毒效應的作用[9]。已有研究表明，依托咪酯可具有直接誘導人肝癌HepG2細胞體外凋亡的作用[10]，依托咪酯抑制A549肺腺癌細胞的侵襲和遷移[5]。因此，依托咪酯具有抗癌作用。鼻咽癌高復發和高轉移與腫瘤細胞的侵襲和遷移能力密切相關，有效抑制人鼻咽癌細胞的侵襲和遷移可以抑制鼻咽癌的發展，如，蛇床子素可抑制CNE2細胞的增殖、侵襲和遷移，其機制可能與調節Wnt/β-catenin信號通路進而抑制EMT過程有關[11]；甲基蓮心堿通過抑制miR-423-5p的表達作用于下游靶基因SMIM3、NGF，抑制上皮間質轉化相關蛋白的表達，從而抑制鼻咽癌細胞的侵襲轉移[12]。本文研究發現，依托咪酯抑制鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞的遷移侵襲，其與Hippo通路激活有關。

Hippo通路響應多種細胞外和細胞內信號，從細胞間的接觸和機械信號到G蛋白偶聯受體的配體和代謝通路。近年來研究發現，Hippo信號通路能夠協調細胞增殖、細胞死亡和細胞分化，調控組織生長的一個高度保守的生長控制信號通路[13]。Hippo通路的核心包含一個核心激酶盒，該核心盒由一對相關的絲氨酸/蘇氨酸激酶、MST1和MST2組成[14]。Hippo信號通路上游膜蛋白受體作為胞外生長抑制信號的感受器，一旦感受到胞外生長抑制信號，就會激活一系列激酶級聯磷酸化反應，最終磷酸化下游效應因子YAP和TAZ[15]。而細胞骨架蛋白會與磷酸化后的YAP和TAZ結合，使它滯留在細胞質內，并刺激它們的泛素介導的蛋白水解作用，降低其細胞核活性，從而實現對細胞生長的調控[16]。 本文研究發現，依托咪酯上調鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞中p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達。當Hippo通路被激活時，其功能相當于腫瘤抑制因子。然而，這一途徑的失調有助于增加細胞增殖，減少細胞凋亡和分化。因此，通過藥理學調節劑調控Hippo信號可能是一種有前途的抗癌策略[17]。Hippo通路具有獨特的致瘤能力，其核心成分(MST1/2、LATS1/2、YAP和TAZ)的突變和表達改變促進了癌細胞的遷移、侵襲和惡性[18]。如，非受體酪氨酸磷酸酶14通過調節Hippo信號通路YAP的磷酸化來促進胃癌細胞的增殖和遷移[19]。已有研究發現，Hippo通路參與鼻咽癌細胞上皮間質轉化[6]，低濃度佛手柑內酯能顯著抑制鼻咽癌的腫瘤干細胞特性，其可能原因與激活腫瘤細胞中Hippo信號通路相關[20]。本文研究發現，添加Hippo通路抑制劑XMU-MP-1可下調p-MST/MST、p-LATS/LATS、p-YAP/YAP蛋白表達，促進鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞的遷移侵襲，同時逆轉依托咪酯對鼻咽癌CNE-1和HNE-1細胞的遷移侵襲的抑制作用。

綜上所述，本文研究發現依托咪酯通過調節Hippo信號通路抑制鼻咽癌細胞CNE-1和HNE-1的侵襲遷移，因此，依托咪酯有望成為鼻咽癌治療的新藥物。本研究僅為體外細胞實驗和機制的初步探討，體內實驗有待進一步研究。