龍虎人丹改善高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細胞肥大的作用研究

王剛，程偉，于澤，丁禮琴，金家驊，金桂芳

(1.江西省高安市中醫(yī)院，江西 高安 330800； 2.廣東藥科大學(xué)，廣東 廣州 510006； 3.上海中華藥業(yè)有限公司，上海 201707)

肥胖是一種臨床常見的慢性代謝性疾病，肥胖常伴隨或并發(fā)糖尿病、高血壓、非酒精性脂肪肝、高脂血癥和心腦血管等疾病，還會增加腫瘤的發(fā)病率[1]。由于高熱量飲食的大量攝入以及久坐不動的生活方式，目前，全球范圍內(nèi)約有1.077億兒童和6.037億成人發(fā)展為肥胖人群，肥胖總體患病率分別為5%和12%[2-4]。如何減肥也日益成為我國衛(wèi)生健康領(lǐng)域的一大難題。然而，除了控制飲食和加強鍛煉,臨床尚缺乏藥效明確、副作用小的減肥藥物[5]。

肥胖的主要特點是脂肪組織重量增加，體脂占比明顯升高，而脂肪細胞儲存的三酰甘油含量持續(xù)增加導(dǎo)致脂肪細胞不斷肥大是引起脂肪組織重量增加的主要原因[6]。脂肪細胞的主要特征是它們能夠以三酰甘油的形式儲存多余的熱量，這些三酰甘油被包裝成占據(jù)脂肪細胞內(nèi)大部分空間的脂滴[7]。在高熱量攝入的早期階段，脂肪細胞會積極地儲存額外的三酰甘油，并在禁食期間保持接近正常脂質(zhì)代謝率；隨著熱量攝入的持續(xù)增加，脂肪細胞會因三酰甘油過度沉積而肥大，并引起脂肪組織重量及占比不斷升高[5-6]。

龍虎人丹是一種中草藥復(fù)方，主要由薄荷、冰片、丁香、砂仁、八角茴香、肉桂、胡椒、木香、干姜、兒茶和甘草等11種成分組成，在臨床上廣泛應(yīng)用于治療中暑、暈動病、腹瀉等病癥，具有療效可靠、副作用少、復(fù)發(fā)率低等優(yōu)點[8-9]。之前的研究表明，龍虎人丹可通過調(diào)節(jié)血脂代謝進而改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠動脈粥樣硬化中的血脂紊亂即能顯著降低血清三酰甘油、總膽固醇和低密度脂蛋白[10]。然而其對于肥胖小鼠中脂肪細胞肥大的保護作用及相關(guān)分子機制尚未有報道。因此，本研究旨在評價龍虎人丹改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪細胞肥大的藥理作用，并進一步探究其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

24只SPF級雄性C57BL/6小鼠，體質(zhì)量20～25 g，8周齡，購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(粵)2018-0034。

1.2 藥品與試劑

龍虎人丹由上海中華藥業(yè)有限公司提供(批號：161006)；蘇木素伊紅(H&E)染液(北京雷根生物技術(shù)有限公司，批號：0729A20)；脂聯(lián)素ELISA試劑盒(武漢華美生物工程有限公司，批號：S22017306)；SYBR Green supermix(美國Bio-Rad公司，批號：64309999)；D12492高脂飼料(Research Diets 公司，批號：150300288)；anti-β-actin 抗體(北京全式金生物技術(shù)有限公司，批號：O10313)；anti-CD36抗體(美國CST公司，批號：1875S，2138S)；HRP標記羊抗兔、羊抗鼠二抗(美國Promega公司，批號：0000390794，0000379490)。

1.3 主要儀器

MULTISKAN GO 全波長酶標儀(美國Thermo Scientific)；LC480熒光定量PCR儀(瑞士Roche)；微型蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國Bio-Rad)；3300029-7Q化學(xué)發(fā)光儀(上海勤翔科學(xué)儀器有限公司)；BX-53熒光顯微鏡(日本Olympus)；BN-5188冰凍切片機(孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司)。

1.4 方法

1.4.1 分組及給藥 將24只小鼠隨機分為4組，每組6只，分別為：正常對照組、模型組、龍虎人丹低劑量組(20 mg/kg，相當于成人臨床最低劑量的9倍)和龍虎人丹高劑量組(40 mg/kg，相當于成人臨床最高劑量的9倍)，每天固定時間進行灌胃給藥，持續(xù)16周。除正常對照組外，其余小鼠均用高脂飲食喂養(yǎng)16周，以誘導(dǎo)小鼠肥胖模型[11]。龍虎人丹使用0.5%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)稀釋。此外，在整個實驗過程中，正常對照組和模型組均灌胃給予0.5%CMC-Na。

小鼠麻醉后進行眼眶取血，血樣室溫保存30 min后，3 000 r/min離心15 min，收集血清，采集的血清樣本在-80 ℃下保存，以備后用。然后脫頸椎處死小鼠，取出附睪白色脂肪組織，用生理鹽水沖洗，液氮速凍后儲存于-80 ℃冰箱中。部分附睪白色脂肪組織在4%(φ)多聚甲醛溶液中固定24 h后以有機溶劑梯度脫水。

1.4.2 組織病理學(xué)檢測 按上述處理方法將部分附睪白色脂肪組織固定于4%多聚甲醛溶液(4 ℃)中過夜，梯度脫水后石蠟包埋，切片(4 μm)后進行HE染色。脂肪細胞相對面積用ImageJ進行定量分析。

1.4.3 脂聯(lián)素測定 按前述方法獲得小鼠血清樣本。血清脂聯(lián)素含量采用商品化脂聯(lián)素ELISA試劑盒依據(jù)說明書進行測定(武漢華美生物工程有限公司)。

1.4.4 小鼠體脂比分析 將小鼠置于EchoMRI動物組分分析儀(EchoMRIIM，中國上海)的測定槽固定后，壓緊測定槽使其無法活動，將測定槽推入動物組分分析儀后測定小鼠的體脂比。

1.4.5 熒光定量PCR[12]以TRIzol法提取各組小鼠部分附睪白色脂肪總RNA并使用PrimeScriptTMgDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄并獲得cDNA。使用SYBR Green法進行熒光定量PCR檢測。所使用的引物如表1所示。以β-actin為內(nèi)參，使用2-△△Ct法計算每個mRNA的相對表達量。

表1 熒光定量PCR中使用的引物序列

1.4.6 Western blot分析[12]脂肪組織浸沒在RIPA裂解液中進行勻漿，4 ℃、12 000 r/min離心30 min后收集上清液。BCA法進行定量，取等量總蛋白(20～40 μg)進行SDS-PAGE凝膠電泳。濕法轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，一抗4 ℃孵育過夜，第2天經(jīng)二抗孵育后用ECL發(fā)光液進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠體脂比的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠的體脂比顯著升高(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠的體脂比明顯降低(P<0.01)，說明龍虎人丹可以有效逆轉(zhuǎn)高脂飲食引起的脂肪組織質(zhì)量增加。見圖1。

2.2 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠血清脂聯(lián)素的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠血清脂聯(lián)素水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠的血清脂聯(lián)素含量明顯上升(P<0.01)。以上結(jié)果提示，龍虎人丹可促進高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪組織分泌脂聯(lián)素。見圖2。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

2.3 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪細胞肥大的影響

脂肪組織HE結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組小鼠脂肪細胞明顯肥大且細胞相對面積顯著增加(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠脂肪細胞明顯減小，細胞面積定量分析也進一步證實龍虎人丹能夠有效抑制高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細胞肥大(P<0.01)。見圖3、4。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。

2.4 龍虎人丹對高脂誘導(dǎo)小鼠脂肪組織脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達的影響

與正常對照組相比，模型組小鼠脂肪組織中脂質(zhì)合成基因PPARγ和ACC的mRNA表達明顯增加(P<0.01)，脂質(zhì)攝取基因CD36的mRNA和蛋白表達均明顯上調(diào)(P<0.01)，作為三酰甘油降解的第一步也是限速酶，ATGL的mRNA表達則明顯下調(diào)(P<0.01)；與模型組相比，龍虎人丹低、高劑量組小鼠PPARγ、ACC的mRNA表達以及CD36的mRNA和蛋白水平均明顯下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，而ATGL的mRNA水平也顯著上升(P<0.01)。以上結(jié)果表明，龍虎人丹可以改善高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠脂肪組織脂質(zhì)代謝基因的紊亂。見圖5、6。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：**P<0.01。

A. PPARY; B. ACC; C. CD36; D. ATGL。1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。與正常對照組比較：##P<0.01； 與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01。

1.正常對照組； 2.模型組； 3.龍虎人丹低劑量組； 4.龍虎人丹高劑量組。

3 討論

長期攝入高熱量飲食會引起肥胖、高脂血癥、糖尿病和非酒精性脂肪肝等一系列代謝性疾病[6,13]。龍虎人丹中的胡椒是一種常見的香料，具有抗氧化和降血脂等作用[14]。最近有研究表明丁香提取物能有效抑制棕櫚酸誘導(dǎo)的脂質(zhì)積聚[15]；肉桂的藥用歷史悠久，其主要有效成分肉桂醛具有抗氧化和抗炎作用，同時對改善糖代謝和脂質(zhì)分布也有重要作用[16-17]；木香是菊科植物木香的干燥根，最新研究證實木香可以改善血糖和血脂[18]；兒茶是豆科植物兒茶的去皮枝、干的干燥煎膏，能顯著抑制三酰甘油的吸收[19]。龍虎人丹可以明顯改善小鼠動脈粥樣硬化中的血脂異常[10]。鑒于龍虎人丹的藥理效用及其對脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)作用，本文研究了其對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪細胞的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，龍虎人丹能夠顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪細胞肥大并能改善脂肪組織中的脂質(zhì)代謝紊亂：(1)龍虎人丹能夠顯著降低肥胖小鼠的脂肪占比；(2)龍虎人丹可以明顯減輕高脂飲食誘導(dǎo)的脂肪細胞擴張和肥大；(3)龍虎人丹治療后，肥胖小鼠脂肪組織中因高脂攝入引起的脂代謝基因表達紊亂得到明顯改善。

脂聯(lián)素是脂肪細胞分泌的一種重要的細胞因子，也是外周血中含量最高的脂肪細胞因子[20]。脂聯(lián)素是機體脂肪組織質(zhì)量增加時唯一呈負相關(guān)的脂肪細胞因子，脂聯(lián)素作為一種胰島素超敏化激素，可以促進骨骼肌細胞脂肪酸氧化和糖吸收，是機體脂質(zhì)代謝和血糖穩(wěn)態(tài)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的重要調(diào)節(jié)因子[21]。同時，脂聯(lián)素能明顯降低外周血中三酰甘油和低密度脂蛋白含量，增加高密度脂蛋白含量,減輕動脈粥樣硬化病變[22]。本研究表明，龍虎人丹能明顯改善高脂飲食引起的脂聯(lián)素分泌減少，從而提高脂肪酸氧化的效率，也提高了三酰甘油利用率，最終明顯減少脂肪細胞內(nèi)三酰甘油的儲存。

CD36是參與脂肪酸代謝的各種組織表面重要的脂肪酸轉(zhuǎn)運體,介導(dǎo)這些組織對脂肪酸的攝取[23]。細胞表面CD36的表達增多會加速細胞對脂肪酸的攝取，并顯著增加細胞內(nèi)三酰甘油的合成，造成脂質(zhì)過度堆積和細胞脂毒性[24]。本研究顯示，龍虎人丹在一定程度上逆轉(zhuǎn)了高脂飼料喂養(yǎng)的小鼠脂肪組織CD36的高表達，進而減輕細胞內(nèi)脂質(zhì)堆積并抑制脂肪細胞肥大。

綜上所述，本研究表明龍虎人丹可以減輕高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠脂肪細胞肥大的組織病變程度，并顯著改善肥胖小鼠脂肪組織中的脂質(zhì)代謝紊亂。由于目前還沒有針對肥胖的特效藥，因此，龍虎人丹有望成為新型安全有效的減肥藥物。