有柄石韋藥材UPLC特征圖譜研究

潘禮業，索彩仙，邱韻靜，吳佳璇，吳文平，李國衛

(廣東一方制藥有限公司/廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244)

石韋始載于《神農本草經》，列為中品，用藥歷史悠久[1]。石韋為水龍骨科植物水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosiasheareri(Baker) Ching、有柄石韋Pyrrossiapetiolosa(Christ)Ching、石韋Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell的干燥葉，味甘苦，微寒，歸肺、膀胱經，具利尿通淋、清肺止咳、涼血止血功效[2]。有柄石韋分布在全國大部分地區，主產于四川、湖北、貴州等省[3]。其他常見石韋地方習用品有華北石韋Pyrrosiadavidii(Baker) Ching，收載于地方標準[4]。據文獻報道，有柄石韋中主要含有三萜、黃酮類化合物、萜酮類、酚酸類等成分[3]。

目前，針對石韋的產地及基原研究較少[5-7]，而以HPLC指紋圖譜對其質量進行評價也主要是針對不同產地或基原藥材進行樣品間的對比分析，并未深層次的探討不同產地或基原藥材樣品之間差異的內在因素，而且石韋中酚酸類成分多，含量差異大，部分酚酸類成分的性質比較接近，利用常規的HPLC很難實現準確、高效的分離與檢測。UPLC法具有更強大的分離能力、超快的分離速度及超高的靈敏度等優點[8-9]，同時在縮短分析時間及減少試劑消耗方面也具有很大的應用前景。本研究擬通過對不同產地有柄石韋進行研究，建立有柄石韋超高效液相特征圖譜，對有柄石韋、石韋、廬山石韋和華北石韋進行系統區分，并嘗試對體現其差異性的內在因素進行探討，為有柄石韋藥材的質量控制提供更科學的參考依據。

1 儀器與材料

Waters H-Class高效液相色譜儀(美國沃特世公司)；Waters CORTECS T3(100 mm×2.1 mm，1.6 μm)色譜柱；ME204E萬分之一分析天平、XP-26百萬分之一分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；KQ500D數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Milli-Q Direct超純水系統(美國默克股份有限公司)。

綠原酸對照品(批號：110753-201817；質量分數：96.8%)、咖啡酸對照品(批號：110885-201703；質量分數：99.7%)為中國食品藥品檢定研究院提供；隱綠原酸對照品(批號：1512701；質量分數：98.0%)為成都普菲德生物技術有限公司提供；新綠原酸對照品(批號：wkq18030107；質量分數：98.0%)、異綠原酸C對照品(批號：wkq1805905；質量分數：98.0%)為四川省維克奇生物科技有限公司提供；甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

樣品經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定為水龍骨科植物廬山石韋Pyrrosiasheareri(Baker) Ching、有柄石韋Pyrrossiapetiolosa(Christ)Ching、石韋Pyrrosialingua(Thunb.) Farwell、華北石韋Pyrrosiadavidii(Baker) Ching的干燥葉，樣品信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters Cortecs T3 C18(2.1 mm×100 mm，1.6 μm)；以甲醇為流動相A，0.1%磷酸為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，7%→15%A；15～18 min，15%→20%A；18～25 min，20%→25%A；25～30 min，25%A；30～35 min，25%→40%A；35～40 min，40%→80%A；40～45 min，80%A)；流速為0.35 mL/min；檢測波長為326 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為1 μL。

2.2 對照品溶液的配制

取新綠原酸、咖啡酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸C對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，配制成質量濃度分別為61.41、17.60、200.11、61.51、54.12 μg/mL的混合對照品儲備液。

2.3 供試品溶液的制備

取樣品粉末(過二號篩)約0.5 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入50%(體積分數，下同)甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理(300 W，40 kHz)30 min，放冷，再稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 精密吸取同一供試品(S1)溶液，按“2.1”項色譜條件連續進樣6次，以綠原酸為參照峰，計算得各主要成分相對峰面積RSD值為0.15%～3.15%，相對保留時間RSD值為0.02%～0.17%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 精密吸取同一供試品(S1)溶液，按“2.1”項色譜條件分別于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，以綠原酸為參照峰，計算得各主要成分相對峰面積RSD值為0.26%～3.38%，相對保留時間值RSD為0.04%～0.26%，表明供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.3 重復性試驗 取同一批號(S1)的有柄石韋樣品6份，每份約0.5 g，按“2.3”項方法制備供試品溶液6份，按“2.1”項色譜條件測定，以綠原酸為參照峰，計算得各主要成分相對峰面積RSD值為0.22%～1.42%，相對保留時間RSD值為0.05%～0.20%，表明方法重復性良好。

2.5 特征圖譜建立與分析

2.5.1 特征圖譜建立與特征峰歸屬 取20批有柄石韋藥材，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行進樣檢測，記錄色譜圖，分別得到20批樣品的特征圖譜，以CDF格式依次導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版)軟件，以S1藥材作為參照圖譜，將時間窗寬度設置為0.1 min，以平均數法作為共有模式圖生成方式，運用多點校正方法，對20批樣品的色譜峰進行手動Mark峰的匹配，建立有柄石韋特征圖譜共有模式，得到9個共有峰，結果見圖1。通過與對照品進行對比，可以確定峰1為新綠原酸，峰3為咖啡酸，峰4為綠原酸，峰5為隱綠原酸，峰9為異綠原酸C，結果見圖2。以峰4綠原酸為參照峰S，20批有柄石韋藥材特征圖譜的其他9個特征峰相對保留時間RSD值在0.08%～2.86%內，相對峰面積的RSD值在14.64%～46.65%內(見表2)，表明不同產地有柄石韋藥材的特征峰對應成分在含量上存在一定波動。

圖1 20批有柄石韋藥材的特征UPLC圖譜

A.混合對照品；B.供試品；1.新綠原酸；3.咖啡酸；4.綠原酸；5.隱綠原酸；9.異綠原酸C。

表2 20批有柄石韋藥材特征圖譜的相對峰面積

2.5.2 相似度分析 根據國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》(2012版)軟件，分析了20批不同產地的有柄石韋藥材的相似度，結果見表3?？梢?，20批有柄石韋特征圖譜的相似度范圍在0.982～1.000，表明不同產地的有柄石韋具有較高的相似度，說明有柄石韋整體質量穩定，具有很好的一致性。

表3 有柄石韋藥材特征圖譜相似度結果

2.5.3 系統聚類分析 運用SPSS 22.0軟件對20批有柄石韋進行系統聚類，以歐氏距離平方和為維度，分析結果見圖3。可見，當判斷距離為10時，20批有柄石韋被分為2類：S1～S3、S8～S10、S14～20聚為一類，即重慶與貴州的樣品聚為一類；S4～S6、S11～S13聚為一類，即四川廣元樣品為一類。當歐氏距離為5時，20批藥材被分為4類：Ⅰ類包括S1～S3、S7、S14、S15、S17，即重慶產樣品與1批貴州樣品聚為一類；Ⅱ類包括S8～S10、S16、S18～S20，即貴州與一批重慶聚為一類；Ⅲ類包括S4～S6，即四川青川聚為一類；Ⅳ類包括S11～S13，即四川旺蒼聚為一類。除S7、S16外，其余聚類結果與產地分布相符，表明產地氣候環境對所產藥材質量有一定影響，S7、S16的差異可能為產地采收加工等因素導致。

2.5.4 偏最小二乘判別分析(PLS-DA) 依據聚類分析結果，對不同產地的5組樣品進行PLS-DA分析，結果見圖4。可見，該PLS-DA模型，R2X(cum)=0.979，R2X(cum)=0.81，Q2(cum)=0.501，均大于0.5，說明模型穩定可靠，可用于不同產地石韋樣品的區分；數據的分類算法中PLS-DA的效果較好，可使5種樣本點完全被分開，相互之間未出現交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區間之內。采用變量重要性投影值(variable importance in project，VIP)篩選體現5個不同產地樣品質量差異的標志物，其中VIP值大于1的成分包括5個，分別為峰1(新綠原酸)、峰2、峰3(咖啡酸)、峰8、峰9(異綠原酸C)，這些成分是體現5個不同產地有柄石韋樣品間成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對樣品的區分影響較小，結果見圖5。

圖3 聚類分析結果

圖4 PLS-DA得分圖

2.5.5 特征圖譜的應用 取廬山石韋S24-S28和S31、華北石韋S21-S23和S30、石韋S29，按“2.3”項方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件進行進樣檢測，記錄色譜圖，得到圖6-圖8。結果顯示，石韋的4個基原(石韋、有柄石韋、廬山石韋、華北石韋)的特征圖譜具有明顯差異。6批廬山石韋的特征圖譜表明，不同地區廬山石韋間的特征圖譜具有共性，其圖譜重合度較高；同樣，4批華北石韋的特征圖譜共性明顯，重合度較高。有柄石韋具有11個共有峰，華北石韋有16個共有峰，廬山石韋有13個共有峰，石韋有12個共有峰，不同石韋基原間的共有峰差異較大，峰1(新綠原酸)、峰2、峰4(綠原酸)、峰5(異綠原酸)為不同基原的共有成分。不同基原的石韋樣品中，華北石韋的圖譜信息最豐富，峰12～峰19均為華北石韋的獨有成分；有柄石韋的成分最簡單，峰30為其獨有成分；峰20～峰26為廬山石韋的獨有成分；峰27～峰29為石韋的獨有成分；另外，峰10為有柄石韋、華北石韋、廬山石韋的共有成分，基原為石韋的樣品中未檢測出該成分；峰3為有柄石韋、華北石韋的共有成分，基原為廬山石韋、石韋的樣品中未檢測出該成分。

圖5 8個化學成分的VIP值

圖6 6批廬山石韋UPLC特征圖譜

圖7 4批華北石韋UPLC特征圖譜

A.有柄石韋; B.華北石韋; C.廬山石韋; D.石韋

3 討論

3.1 分析方法的優化

比較了乙醇、70%乙醇、稀乙醇、甲醇、70%甲醇、50%甲醇6種提取溶劑，結果顯示甲醇、乙醇、70%乙醇作為提取溶劑時，峰形較差，70%甲醇、50%甲醇、稀乙醇的提取效果較接近，結合色譜峰的總特征峰與稱樣量比值、色譜峰分離效果結果來看，最終選取50%甲醇作為提取溶劑。比較不同檢測波長，結果顯示在326 nm波長下，色譜基線噪音比較低，特征響應值較高，色譜信息比較完全，故選擇326 nm作為檢測波長。

3.2 特征圖譜的分析

本研究通過建立了20批不同產地的有柄石韋藥材的超高效液相特征圖譜，超高效液相與傳統的高效液相色譜相比分析時間較短，提高了效率，特征圖譜不僅能夠在一定程度上反映有柄石韋的整體性，也能反映出其特異性；通過相似度評價分析得到20批藥材特征圖譜相似度均>0.98，各產地間亦均表現出很高的相似度，說明藥材質量總體較為穩定，能反映產地真實情況；聚類分析結果顯示樣品基本可以按產地進行聚類，個別批次未與產地聚類，或因受采收加工影響導致；偏最小二乘判別分析與聚類分析，能互相支持佐證，不同地區的有柄石韋整體表現出很高的相似性，且具有各自內在的區別。

3.3 不同基原樣品的比較

本研究在建立有柄石韋特征圖譜的基礎上，對4種不同基原的石韋樣品進行了比較，通過圖譜的直觀分析，可以明顯區分不同石韋基原。其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸為不同石韋基原樣品的共有成分，提示酚酸類成分可能為不同基原石韋藥材的物質基礎之一，可能也是導致不同石韋基原的藥理藥效一致的因素。但不同基原的石韋樣品其特征圖譜差異較大，華北石韋與2015年版《中國藥典》上收載的3個基原(石韋、有柄石韋、廬山石韋)區別明顯，成分最為豐富，具有16個共有峰，8個特有成分?！吨袊幍洹肥蛰d的3個法定基原中，石韋和有柄石韋則表現出較高的相似性，具有8個共有峰，有柄石韋中僅有2個成分在石韋中未檢出，石韋中則有4個成分在有柄石韋中未檢出；廬山石韋則在15 min后的圖譜中表現出與石韋及有柄石韋的明顯差異。據文獻報道，石韋與有柄石韋2個基原的性狀較為接近，廬山石韋則在性狀則與前兩者具有較大差異[6]，結合本研究的結果，說明這3個基原的性狀差異與成分差異具有高度的一致性。

本研究通過在建立有柄石韋特征圖譜的基礎上，對不同基原的石韋樣品進行了對比分析，其結果科學、可靠，為石韋藥材的質量研究提供了新方法。本研究僅對不同基原石韋的樣品進行了對比分析，并未對其差異成分進行確證，下一步可通過LC-MS/MS技術對不同基原石韋的差異成分進行研究，進一步揭示不同基原石韋的差異物質基礎。