安神補腦膠囊HPLC指紋圖譜與3種成分含量測定方法研究

吳嫣艷，任會旭，馮友龍，張莉，張妤琳

(1.江蘇省食品藥品監督檢驗研究院，江蘇 南京 210019； 2.南京中醫藥大學，江蘇 南京 210023)

安神補腦膠囊為2019年國家評價性抽驗品種，處方由鹿茸、制何首烏、淫羊藿、干姜、甘草、大棗、維生素B1組成，具有生精補髓、增強腦力的功效，用于神經衰弱、失眠、健忘、頭暈[1-3]。本次抽樣涉及的3個廠家分別執行國家食品藥品監督管理局標準YBZ15322009、YBZ08452009、YBZ02542009，均僅有何首烏中所含的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量測定項，質控不夠全面。本研究參考文獻[4-13]建立了安神補腦膠囊的HPLC指紋圖譜及測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸質量分數的方法，為該制劑的整體質量控制提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AB高效液相色譜儀，LC solution色譜工作站(日本島津公司)；BS21S 型電子天平(北京賽多利斯天平有限公司)。

1.2 試藥

3個廠家的50批次安神補腦膠囊樣品由國家藥品評價性抽樣中各省藥監局提供；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(批號110844-201814，質量分數91.0%)、淫羊藿苷(批號110737-201516，質量分數94.2%)、甘草酸銨(批號110731-201720，質量分數97.7%)、維生素B1(批號100390-201806，質量分數97.9%)、朝藿定C(批號111780-201804，質量分數92.6%)、大黃素(批號110756-201512，質量分數98.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；朝藿定A(批號R11N7F24698，質量分數98.0%)、朝藿定B(批號P25F8F30154，質量分數98.0%)、大黃素-8-β-D吡喃葡萄糖苷(批號P17A10F86138，質量分數98.0%)、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷(批號P16N9F75128，質量分數96.0%)、淫羊藿次苷Ⅰ(批號YJ0628SA14，質量分數98.0%)、寶藿苷Ⅰ(批號R11M8F31212，質量分數98.0%)、大黃素甲醚(批號T09M9F55482，質量分數98.0%)均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、磷酸均為色譜純，水為去離子水，其余均為分析純。

2 方法與結果

2.1 HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 對照品溶液的制備 取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨、維生素B1、朝藿定C、大黃素、朝藿定A、朝藿定B、大黃素-8-β-D吡喃葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿次苷Ⅰ、寶藿苷Ⅰ、大黃素甲醚對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL分別含10 μg的混合對照品溶液，即得。

2.1.2 供試品溶液的制備 取膠囊內容物，研細，取約0.4 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，定容，濾過，取續濾液，即得。

2.1.3 色譜條件 采用ACE Excel C18色譜柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；以乙腈為流動相A，以0.05 mol/L磷酸溶液為流動相B，進行梯度洗脫，洗脫程序見表1；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：270 nm；進樣量：20 μL。

表1 HPLC指紋圖譜梯度洗脫程序

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，精密吸取20 μL，按“2.1.3”項色譜條件進樣測定6次，記錄色譜圖，導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，測得相似度在0.998～1.000之間，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗 取同一批安神補腦膠囊，按“2.1.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，各精密吸取20 μL，按“2.1.3”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，測得相似度在0.998～1.000之間，表明方法重復性良好。

2.1.4.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1.3”項色譜條件于0、2、4、8、12、24 h進樣測定，記錄色譜圖，測得相似度在0.999～1.000之間，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 特征峰歸屬 取10批安神補腦膠囊(廠家A 3批、廠家B 3批、廠家C 4批)按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，另吸取“2.1.1”項下對照品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.1.3”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(見圖1)，各色譜峰歸屬見表2。

注：各色譜峰歸屬見表2。

表2 安神補腦膠囊HPLC指紋圖譜色譜峰歸屬

2.1.6 對照指紋圖譜的生成 取“2.1.2”項下10批供試品溶液色譜圖，以表2中所述13個峰為特征峰計算，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》生成對照指紋圖譜，見圖2。

2.1.7 相似度評價 取50批安神補腦膠囊，按“2.1.2”項方法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，按“2.1.3”項色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》，以特征峰計算，結果相似度在0.962～0.997之間。

2.2 安神補腦膠囊中3種成分的測定

2.2.1 溶液的制備

2.2.1.1 混合對照品溶液 取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加稀乙醇制成每1 mL分別含50、15、10 μg的混合對照品溶液，即得(甘草酸質量=甘草酸銨質量/1.0207)。

圖2 10批安神補腦膠囊指紋圖譜與對照指紋圖譜(R)的HPLC疊加圖

2.2.1.2 供試品溶液 取內容物研細，取約0.4 g，精密稱定，置50 mL棕色量瓶中，加稀乙醇40 mL，超聲處理30 min，取出，放冷，定容，濾過，取續濾液，即得。

2.2.1.3 陰性對照溶液 按處方比例稱取除制何首烏、淫羊藿、甘草以外的其他味藥，按制備工藝制成不含制何首烏、淫羊藿、甘草的陰性供試品，按“2.2.1.2”項方法操作，制得不含制何首烏、淫羊藿、甘草的陰性對照溶液。

2.2.2 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈為流動相A，以0.05 mol/L磷酸溶液為流動相B進行梯度洗脫(洗脫程序見表3)；流速為1 mL/min，柱溫為35 ℃，PDA檢測器；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷檢測波長為320 nm，淫羊藿苷檢測波長為270 nm，甘草酸銨檢測波長為250 nm；進樣量為10 μL。

表3 含量測定梯度洗脫程序

2.2.3 專屬性試驗 分別取“2.2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液，按“2.2.2”項色譜條件下進樣分析。結果顯示理論塔板數按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰計算均大于5 000，陰性對照對測定無干擾，見圖3。

A. 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷對照品溶液320 nm； B.淫羊藿苷對照品溶液270 nm； C.甘草酸銨對照品溶液250 nm； D～F.供試品溶液320、270、250 nm； G～I.陰性對照溶液320、270、250 nm。

2.2.4 線性關系考察 精密稱取2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨對照品適量，加稀乙醇制成濃度分別為0.2、1、2、10、40、80、100、200 μg/mL的標準系列溶液。按“2.2.2”項色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以對照品的濃度為橫坐標、峰面積積分值為縱坐標繪制標準曲線，結果得到：2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷，y=35 296.910 7x+37 219.281 7，r=0.999 5，線性范圍0.19～190.52 μg/mL；淫羊藿苷，y=20 624.461 9x+ 3 950.279 0，r=0.999 9，線性范圍0.20～197.41 μg/mL；甘草酸(甘草酸質量=甘草酸銨質量/1.0207)，y=8 175.735 2x+ 3.211 5，r=0.999 9，線性范圍0.19～192.47 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 取“2.2.1”項混合對照品溶液，按“2.2.2”項色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨峰面積的RSD值(n=6)分別為0.08%、0.10%、0.20%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取批號為190120的樣品，按“2.2.1”項方法制備6份供試品溶液，在上述色譜條件下進樣分析，結果得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨質量分數的RSD值分別為1.40%、1.29%、1.70%，表明方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取“2.2.6”項下供試品溶液(批號190120)，在“2.2.2”項色譜條件分別在0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣，記錄峰面積。結果得到2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨峰面積的RSD值(n=8)分別為0.28%、0.25%、1.37%，表明方法穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取已知含量樣品(批號190120)6份，每份精密稱取0.2 g，置50 mL棕色量瓶中，精密加入混合對照溶液(2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨濃度分別為1.655 3、0.950 5、0.144 7 mg/mL)1 mL，按“2.2.1”項方法制備供試品溶液，按“2.2.2”項色譜條件進樣測定。結果測得2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨的平均加樣回收率分別為100.04%、97.33%、97.00%，RSD(n=6)分別為1.43%、1.11%、1.23%，表明方法具有良好的準確性。

2.2.9 耐用性試驗 取批號為1901072的樣品，按“2.2.1”項下方法平行制備2份供試品溶液，按“2.2.2”項色譜條件進樣分析，色譜柱分別采用Agela Durashell RP C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、Agilent ZOBAX SB-C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)、ACE Excel C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)，結果顯示理論板數按2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷峰計算均大于5 000，分離度良好，3根色譜柱2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸銨質量分數RSD值分別為0.68%、0.50%、1.91%。

2.2.10 樣品含量測定 取50批次安神補腦膠囊，按“2.2.1”項方法操作，制備供試品溶液各2份，按“2.2.2”項色譜條件測定，結果測得50批次安神補腦膠囊樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸的質量分數范圍分別為2.4～4.8、0.24～1.96、0.04～0.49 mg/粒，見表4。

表4 各成分質量分數的測定結果

3 討論

近年來，指紋圖譜廣泛應用于中藥質量控制研究。本研究建立了安神補腦膠囊的HPLC法指紋圖譜，并對50批次樣品進行了篩查，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統建立了標準指紋圖譜，考察樣品的相似度，以期達到更全面地控制制劑整體質量的目的。

安神補腦膠囊由國家藥品監督管理局《國家中成藥標準匯編》(中成藥地方標準上升國家標準部分)內科心系分冊收載的“安神補腦片”改變劑型而來，方中制首烏補肝腎、益精血、養心安神，淫羊藿補腎陽、強筋骨，甘草則有調和諸藥的功效。本文結合安神補腦膠囊處方制法，參考《中國藥典》2015年版一部收栽的制何首烏、淫羊藿、甘草的含量測定項目[1]，分別選擇2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸3種成分建立含量測定方法，以有效控制安神補腦膠囊制劑質量。

對50批安神補腦膠囊樣品中2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸質量分數測定結果用SPSS軟件進行統計分析，結果見圖4。可見，淫羊藿苷與甘草酸2個成分的質量分數企業之間的差異較大。原法定質量標準中，均僅有何首烏中所含的2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷的含量測定項，而對淫羊藿與甘草酸沒有進行控制。本文建立安神補腦膠囊HPLC指紋圖譜，同時測定2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷、淫羊藿苷、甘草酸3種成分的質量分數，該方法準確、靈敏、可靠，為安神補腦膠囊的質量控制提供了依據，對原質量標準進行了提升。

A. 2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷； B.淫羊藿苷； C.甘草酸)。