殼聚糖對阿昔洛韋滴眼劑兔眼房水藥動學的影響

宋玲，胡擁軍，黃理

(1.湖北省婦幼保健院藥劑科，湖北 武漢 430070； 2.武漢大學人民醫院藥學部，湖北 武漢 430060)

阿昔洛韋(aciclovir，ACV)對單純皰疹性角膜炎有較好的療效，但ACV滴眼液存在因鼻淚管引流引起的全身不良反應、生物利用度低、藥效維持時間短等缺點[1]。殼聚糖(chitosan，CS)為一種陽離子多糖，具有生物黏附性、生物相容性、促滲透性等特性，已廣泛地應用于眼部給藥系統[2]。本課題組前期已將CS作為增黏劑及吸收促進劑應用于ACV滴眼液中，并對其體外質量、家兔眼部刺激性及滯留性、對離體角膜滲透促進作用等進行了研究[3-4]。本部分研究擬以不加CS的ACV滴眼液(ACV)為對照，考察CS對ACV滴眼液在兔眼房水中藥動學的影響，為進一步藥效學研究奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1100高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；TD4臺式離心機(湖南儀器儀表總廠離心機廠)。

1.2 試藥

阿昔洛韋原料藥(ACV，湖北潛江制藥股份有限公司，批號：20180222，質量分數：99.55%)；ACV對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：140630-201802，質量分數：99.8%以上)；殼聚糖(CS，青島海普生物技術有限公司，藥用級，相對分子量210 000，脫乙酰度大于95%)；ACV-CS滴眼液、ACV滴眼液(質量濃度為0.1%，自制[3-4]，批號均為：20190511)；谷胱甘肽-碳酸氫鈉林格溶液(GBR，使用前新鮮自配[4])；鹽酸丁卡因(湖北健文生物醫藥有限公司，批號：20181203，配制成1%溶液備用)；磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.5，參照2015年版《中國藥典》配制)；噴昔洛韋(penciclovir，PCV，中國食品藥品檢定研究院，批號：100147-201702，質量分數：99.5%)；以上及其他試劑均為分析純。

1.3 動物

日本大耳白兔，雌雄兼用，武漢生物制品研究所提供，普通級，體質量1.8～2.0 kg，合格證號：SCXK(鄂)2008-0003(00019663)。

2 方法與結果

2.1 滴眼液的制備[3-4]

2.1.1 ACV-CS滴眼液 ACV 1.0 g，CS 5.0 g，NaCl 6.8 g，羥苯乙酯0.3 g，注射用水加至1 000 mL。取羥苯乙酯溶于適量注射用水中，加入ACV、NaCl，攪拌使溶解，濾過。另取CS加入適量注射用水中，加入冰醋酸5 mL，使自然膠溶完全后，濾過。將上述2種溶液混合，攪勻，調節pH值至6.0～6.5，加注射用水至1 000 mL，攪勻，于100 ℃流通蒸氣滅菌30 min，無菌分裝即得。

2.1.2 ACV滴眼液 ACV 1.0 g，NaCl 6.8 g，羥苯乙酯0.3 g，注射用水加至1 000 mL。取羥苯乙酯溶于800 mL的注射用水中，加入ACV、NaCl，攪拌使溶解，用鹽酸調節pH值至6.0～6.5，加注射用水至1 000 mL，攪勻，濾過，于100 ℃流通蒸氣滅菌30 min，無菌分裝即得。

2.2 分組給藥及房水采集

采用每只白兔自身對照、交叉設計進行實驗[5]。取55只健康白兔，隨機分為11個時間組，每組5只(10眼)，采用微量取樣器于眼結膜囊內滴加相應滴眼液60 μL(含ACV 60 μg)。給藥后分別于10、20、40、60、90、120、150、180、240、300、360 min抽取房水樣本：用生理鹽水沖洗結膜囊及角膜表面，棉簽蘸干，以1%鹽酸丁卡因表面麻醉，用1 mL注射器抽取房水，再精密吸取100 μL于帶塞的離心管中于-20 ℃下儲存備用。經7 d清洗期后，交叉給藥，同法處理。

2.3 房水樣品中ACV的提取分離[6]

取房水100 μL，精密加入15 μg/mL PCV內標液5 μL，加入25%高氯酸溶液100 μL，振蕩2 min，高速離心(10 000 r/min)20 min后，取上清液100 μL于1.5 mL離心管中，1 mol/L Na2CO3溶液60 μL調pH值至弱酸性，高速離心(10 000 r/min)20 min后，取上清液備用。

2.4 色譜條件

參考文獻[7]，并通過預實驗調整色譜條件如下：色譜柱為Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長為254 nm；流動相為甲醇-水(體積比15∶85)；流速為1.0 mL/min；柱溫為35；靈敏度為0.02 UFS；進樣量為10 L。以內標法進行測定，見圖1，可見滴眼液中其他成分不干擾ACV的測定。

1.ACV； 2.噴昔洛韋； A.空白房水； B.輔料； C. ACV+內標液； D. ACV對照品； E.兔眼給藥后房水。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線 精密稱取ACV對照品5.0 mg，用純水定容至100 mL，分別精密吸取0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mL置于100 mL量瓶，用純水定容，即得濃度分別為0.05、0.25、0.50、1.00、2.50、5.00 μg/mL的對照品溶液，各精密吸取10 μL，用空白房水稀釋至50 μL，進樣檢測，以峰面積(A)與對應質量濃度(ρ)進行線性回歸，得回歸方程A=5.06×104ρ+2.68×103，r=0.999 8(n=6)，表明ACV質量濃度在0.01～1.00 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

2.4.2 提取回收率及精密度 取質量濃度分別為0.5、2.50、5.00 μg/mL的ACV對照品溶液10 μL，用空白房水稀釋至50 μL，配制成0.10、0.50、1.00 μg/mL的ACV房水溶液，依照“2.2”項方法處理后進樣檢測，得到峰面積A1。每個濃度5份，每天連續測5次，連續測定5 d，計算日內及日間精密度。同時流動相溶液中加入適量ACV和內標溶液，配制成與房水質控樣品理論進樣溶液相同濃度的溶液進樣分析，得峰面積A2。以A1/A2的比值求算ACV提取回收率。結果見表1，表明提取回收率較高，日內及日間精密度均較好。

2.4.3 穩定性試驗

2.4.3.1 室溫穩定性 精密配制低、中、高質量濃度的ACV房水樣品(0.20、2.00、4.50 μg/mL)，每個濃度平行配制5份。室溫下分別放置0、2、4、6、8 d進樣檢測，與0 d相比計算含量偏差。結果表明ACV房水樣品在室溫放置 8 d可保持穩定，RSD≤2.0%。

表1 提取回收率及精密度測定結果

2.4.3.2 冷藏穩定性 配制低、中、高質量濃度的ACV房水樣品，于4 ℃冰箱中放置，每天測定，連續測定5 d，與0 d相比計算含量偏差。結果表明ACV房水樣品在4 ℃下5 d內保持穩定，RSD≤1.5%。

2.4.3.3 凍融穩定性 同法配制低、中、高質量濃度的ACV房水樣品，于-20 ℃冷凍24 h，取出自然完全解凍，再冷凍，反復循環3次，進樣檢測ACV含量，與未凍融前相比，結果表明，ACV房水樣品凍融穩定性良好，RSD≤2.0%。

2.5 數據處理

主要藥動學參數見表2、表3。對血藥濃度及時間的數據進行房室模型擬合，表明2種制劑在兔眼房水的經時變化情況均符合二室模型(權重因子為1)，相關系數r2=0.999 9。給藥20 min內，ACV滴眼液的房水藥物濃度顯著高于ACV-CS滴眼液，而20 min后，在各個時間點，ACV-CS滴眼液的血藥濃度明顯高于ACV滴眼液，Cmax為ACV滴眼液的1.31倍，AUC0-t為ACV滴眼液的1.77倍，說明ACV-CS滴眼液的吸收明顯增加，生物利用度顯著提高(P<0.05)。ACV滴眼液較快達峰，而ACV-CS滴眼液的Tmax顯著滯后，且MRT顯著延長(P<0.05)，說明ACV-CS滴眼液具有明顯的緩釋長效作用。

表2 ACV-CS滴眼液及ACV滴眼液兔眼房水中的藥物濃度

表3 ACV-CS滴眼液及ACV滴眼液單次給藥后兔眼主要藥動學參數

3 討論

本研究采用家兔自身對照、交叉設計法進行試驗，可減少樣本數且平行操作，結果較為可靠。

CS作為自然界唯一帶正電荷的陽離子多糖，已經作為有效的吸收促進劑應用于眼部給藥系統，其機理為CS正電荷有利于與角膜上帶負電荷的黏蛋白結合，顯著提高藥物穿透角膜進入房水的吸收作用[8]。本課題組前期離體角膜滲透試驗結果顯示，由于CS的黏性，可增加ACV在眼部的滯留性，減少藥液的流失，并發揮吸收促進作用，顯著增加了ACV離體角膜的滲透性[4]。本文的體內研究結果與以上體外結果相似，ACV-CS滴眼液由于CS的黏性作用，均存在20 min的吸收時滯，但20 min后CS發揮明顯的吸收促進作用，使ACV更容易穿透角膜進入房水，生物利用度明顯增加，作用時間顯著延長。CS作為ACV滴眼液的增黏劑及吸收促進劑，具有較好的研發價值。

本研究中CS的應用濃度為0.5%，初步安全性評估結果顯示對家兔眼部沒有明顯刺激性[10]。CS的正電荷在發揮相應吸收促進劑的同時，也會對細胞產生一定的毒性[9]，故應對CS在ACV滴眼液中的使用濃度進一步優化，兼顧黏性、吸收促進作用及安全性。