基于納米級(jí)粗糙表面甘露醇載體吸入粉霧劑的初步穩(wěn)定性研究

王冠林，張雪娟，梁瑞峰，黃瑩，潘昕，吳傳斌

(1.中山大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510006； 2.暨南大學(xué)藥學(xué)院，廣東 廣州 510632)

目前，肺部藥物傳遞系統(tǒng)已成為治療肺部疾病的主要研究方向[1]。常見肺部給藥劑型主要有吸入氣霧劑、吸入噴霧劑和吸入粉霧劑(Dry powder inhalers，DPIs)，其中DPIs以固態(tài)形式存在，穩(wěn)定性高，且不含拋射劑，應(yīng)用前景廣闊[2]。根據(jù)處方組成，DPIs可分為載體型和無載體型兩大類[3]。加入載體可顯著改善DPIs的流動(dòng)性和分散性，并且提高制劑的貯存穩(wěn)定性，目前市售的DPIs中90%以上含有載體[4]。在載體型DPIs的吸入過程中，載體攜帶藥物顆粒隨患者呼吸進(jìn)入口咽部、氣管、支氣管，而在支氣管較窄處，載體由于其較大粒徑無法順利通過而沉積此處，藥物顆粒必須從載體上脫離，才可進(jìn)入肺部深處[5]。研究表明，藥物與載體之間更小的脫附力可產(chǎn)生更高的沉積效率，而脫附力與DPIs載體表面粗糙度具有重大關(guān)聯(lián)[6-7]。因此，對(duì)載體進(jìn)行表面改性，如構(gòu)建粗糙表面是一種有效改善DPIs肺部藥物遞送效率的策略。

本課題前期研究中已成功采用噴霧干燥法一步構(gòu)建具有可控納米級(jí)粗糙表面的改性甘露醇載體(Surface modified mannitol carrier,SMMC)，能夠顯著降低藥物與載體之間的脫附力，提高DPIs的肺部藥物遞送效率[8]，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。對(duì)于DPIs而言，制劑穩(wěn)定性直接關(guān)系到臨床用藥的安全性和有效性。本研究以布地奈德(Budesonide，BUN)為模型藥物，初步考察基于納米級(jí)粗糙表面的甘露醇載體制備的吸入粉霧劑(SMMC-DPIs)的穩(wěn)定性，如影響因素穩(wěn)定性、加速及長期穩(wěn)定性，為其后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)、包裝、貯存、運(yùn)輸條件提供相關(guān)理論依據(jù)，以保障臨床用藥安全。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-20AT系列高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)； Luna C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Phenomenex公司)；新一代藥用撞擊器(Next generation impactor,NGI，英國Copley Scientific公司)；2XZs(S)-2形旋片式真空泵(上海德英真空照明設(shè)備有限公司)；3#Turbospin?干粉吸入器(意大利PH&T公司)；LHH-250GSP藥品強(qiáng)光穩(wěn)定性試驗(yàn)箱(上海一恒集團(tuán))；KBF-115恒溫恒濕箱(德國BINDER公司)。

1.2 試藥

3#明膠膠囊(蘇州膠囊公司)；布地奈德原料藥(宜昌永諾藥業(yè)，批號(hào)：YN201709020-1)；布地奈德標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100989-201502)；甘露醇(天津大茂化學(xué)試劑廠，批號(hào)：20171101)；殼聚糖鹽酸鹽(脫乙酰度：90.2%，黏度：28 mPa·s，山東奧康生物科技有限公司，批號(hào)：160928W)；微粉化布地奈德(自制，批號(hào)：YN20180908)；納米級(jí)粗糙表面改性甘露醇(自制，批號(hào)：YN20180908，YN20181010，YN20181208)；布地奈德吸入粉霧劑(自制，批號(hào)：D20180910，D20181011，D20181210)；乙腈(色譜純，美國Fisher公司，批號(hào)：165836)；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 SMMC-DPIs的制備

將甘露醇和殼聚糖以質(zhì)量比70∶30混合，溶解于體積分?jǐn)?shù)30%乙醇溶液中(質(zhì)量濃度為2%)，采用噴霧干燥法制備SMMC[8]。將SMMC與微粉化的BUN以質(zhì)量比30∶1混合，批量為100 g。精密稱取上述混合粉末0.010 0 g，手動(dòng)填充于3#明膠膠囊，即得SMMC-DPIs，每顆膠囊含BUN 0.3226 mg。

2.2 BUN的含量測定方法

含量測定是穩(wěn)定性研究中的重要指標(biāo)[9]。本研究制備的SMMC-DPIs中BUN含量低[8]，且BUN在光下易發(fā)生分子重排產(chǎn)生同分異構(gòu)體雜質(zhì)[10]，因此采用靈敏度高且可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)進(jìn)樣的高效液相色譜法測定BUN的含量，實(shí)驗(yàn)均在避光條件下完成。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Luna C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；美國Phenomenex)；流動(dòng)相：乙腈-水(體積比70∶30)；檢測波長：240 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 方法學(xué)考察

2.2.2.1 專屬性試驗(yàn) 精密稱取BUN原料藥0.010 0 g，按處方量與空白輔料甘露醇、殼聚糖物理混合，配制成BUN質(zhì)量濃度約10 μg/mL的供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測，BUN與相鄰雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求。另取處方量空白輔料甘露醇和殼聚糖物理混合，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件檢測，結(jié)果見圖1。可見，BUN保留時(shí)間約為4.7 min，與空白輔料分離度良好，未見雜質(zhì)峰，空白輔料色譜圖中未見吸收峰，甘露醇和殼聚糖在240 nm檢測波長下無吸收，對(duì)BUN的檢測無干擾。

2.2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密稱取BUN 對(duì)照品0.016 8 g，置于10 mL的容量瓶中，加入適量無水乙醇制成1 680 μg/mL 的對(duì)照品溶液。分別精密吸取適量對(duì)照品溶液于10 mL 容量瓶中，加入無水乙醇定容成質(zhì)量濃度為168.00、126.00、84.00、33.60、16.80、3.36、1.68 μg/mL的系列溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行檢測。以BUN 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得回歸方程A=34 984c+ 20 021.3(R2=0.999 9，n=7)，表明BUN在1.68～168 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

A.供試品溶液； B. BUN對(duì)照品溶液； C.空白輔料。

2.2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密稱取BUN 對(duì)照品0.005 0 g，置于100 mL的容量瓶中，加入無水乙醇制成50 μg/mL 的對(duì)照品溶液，并通過稀釋得到質(zhì)量濃度為10 μg/mL和2 μg/mL的溶液。取高、中、低3個(gè)濃度的樣品溶液分別按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件重復(fù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，計(jì)算RSD值。結(jié)果測得高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度溶液的RSD值分別為0.67%、1.11%、1.27%，表明儀器精密度良好。

2.2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密稱取BUN對(duì)照品0.005 0 g，置于100 mL的容量瓶中，加入無水乙醇制成50 μg/mL 的對(duì)照品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、18、24 h測定BUN濃度，計(jì)算峰面積的變化。結(jié)果測得峰面積RSD值為0.64%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

2.2.2.5 回收率試驗(yàn) 精密稱取3份BUN對(duì)照品各0.010 0 g，按處方量加入輔料，用無水乙醇配成含BUN高、中、低濃度分別約為20、15、10 μg/mL的溶液，按“2.2.1”項(xiàng)色譜條件測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算測得量，由測得量和加入量計(jì)算回收率，結(jié)果顯示低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的平均回收率在99%～102%之間，RSD均小于2%，表明方法準(zhǔn)確穩(wěn)定。

2.3 穩(wěn)定性研究考察項(xiàng)目

根據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則[11]和吸入制劑研究技術(shù)質(zhì)量控制指導(dǎo)原則[12]，考察SMMC-DPIs的外觀性狀、排空率、遞送劑量均一性(Delivery dose uniformity，DDU)、微細(xì)粒子劑量(Fine particle dose，F(xiàn)PD)和空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布(Aerodynamic particle size distribution，APSD)，進(jìn)而評(píng)價(jià)制劑高溫、高濕及強(qiáng)光影響因素穩(wěn)定性，加速試驗(yàn)穩(wěn)定性和長期試驗(yàn)穩(wěn)定性。

2.3.1 外觀性狀 本品內(nèi)容物應(yīng)為白色疏松粉末，膠囊殼結(jié)構(gòu)完整。

2.3.2 遞送劑量均一性 根據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則“0111吸入制劑通則”[11]，采用吸入粉霧劑遞送劑量均一性測定裝置測定SMMC-DPIs遞送劑量(Delivery dose，DD)：取待測膠囊1顆，置于吸入裝置內(nèi)，啟動(dòng)真空泵抽吸4 s，氣流流速為60 L/min，以無水乙醇清洗濾紙和收集管內(nèi)部，合并清洗液測定BUN含量。重復(fù)上述操作，共測定10顆膠囊。

2.3.4 空氣動(dòng)力學(xué)粒徑分布和微細(xì)粒子劑量 根據(jù)《中國藥典》2020年版四部通則“0951吸入制劑微細(xì)粒子空氣動(dòng)力學(xué)特性測定法”[11]，采用NGI及HPLC測定SMMC-DPIs的APSD，并采用CITDAS軟件(英國Copley Scientific公司)計(jì)算FPD，評(píng)價(jià)DPIs的肺部藥物遞送效率[13-15]。取待測膠囊置于吸入裝置中，啟動(dòng)真空泵抽氣每顆4 s，每次10顆，氣流流速為60 L/min。分別收集并測定吸入器和適配器、L型連接管、預(yù)分離器、S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和MOC藥物含量。每個(gè)處方重復(fù)3次，取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(Standard deviation,SD)。

2.4 吸入粉霧劑影響因素試驗(yàn)

取自制SMMC-DPIs暴露于高溫(60±0.5)℃，高濕[(90±5)%RH和(75±5)% RH)]和強(qiáng)光[(4 500±500) lx]條件下，分別于第0、5、10 d按“2.3”項(xiàng)穩(wěn)定性考察項(xiàng)目對(duì)SMMC-DPIs進(jìn)行考察。

2.5 吸入粉霧劑加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

取自制SMMC-DPIs，采用鋁塑泡罩包裝后與袋裝干燥劑一起裝入鋁袋并密封，在(40±2)℃、(75±5)%RH的條件下放置第1、2、3個(gè)月末時(shí)分別取樣1次，按“2.3”項(xiàng)穩(wěn)定性考察內(nèi)容進(jìn)行檢測。

2.6 吸入粉霧劑長期穩(wěn)定性試驗(yàn)

取自制SMMC-DPIs，采用鋁塑泡罩包裝后與袋裝干燥劑一起裝入鋁袋并密封，在(25±2)℃、(60±10)%RH的條件下放置0、3、6個(gè)月時(shí)取樣，按“2.3”項(xiàng)穩(wěn)定性考察項(xiàng)目進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 吸入粉霧劑影響因素試驗(yàn)

影響因素試驗(yàn)考察結(jié)果如表1所示?？梢?，SMMC-DPIs在高溫和強(qiáng)光條件下樣品外觀性狀未見明顯變化，同批次試驗(yàn)10顆膠囊遞送劑量均在平均值75%～125%之間，排空率大于90%，F(xiàn)PD大于標(biāo)示劑量的10%，符合《中國藥典》要求。同時(shí)，10 d內(nèi)DD、ED和FPD間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。APSD如圖2所示，與0 d相比，在高溫(圖2A)和強(qiáng)光(圖2B)條件下貯存10 d對(duì)DPIs體外沉積各級(jí)分布無顯著影響，制劑的吸入性能基本不變。

由于樣品在25 ℃、(90±5)%RH條件下放置5 d后，吸濕增重超過5%，故改為在25 ℃、75%RH條件下進(jìn)行高濕穩(wěn)定性試驗(yàn)。高濕條件貯存5 d后觀察到樣品外觀性狀無明顯變化，但是貯存10 d后部分膠囊殼軟化。DD和排空率與0 d相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但是FPD略有下降(P<0.05)，原因可能是樣品吸濕團(tuán)聚導(dǎo)致其空氣動(dòng)力學(xué)粒徑增大，從而使得DPIs在預(yù)分離器處沉積增加，在S3～S6處沉積減少，因此FPD下降。APSD如圖2C所示，樣品在預(yù)分離器沉積增加，在S3～S6 4個(gè)撞擊盤的沉積減少(在測試氣流下，預(yù)分離器截留粒徑>8.06 μm，S3～S6截留粒徑為0.55～4.46 μm[16])，表明可能存在粉末團(tuán)聚現(xiàn)象，將內(nèi)容物從膠囊殼中傾倒出來時(shí)，也發(fā)現(xiàn)有極少量細(xì)粉黏附于膠囊殼內(nèi)壁上，這可能是水分滲透明膠膠囊殼，囊殼軟化所致。貯存10 d后吸濕增重百分率為(4.65±0.26)%，也進(jìn)一步表明在高濕條件下確實(shí)存在囊殼吸濕現(xiàn)象。一方面，囊殼吸濕后易發(fā)生軟化或裂片，阻滯膠囊內(nèi)容物隨氣流的分散；另一方面，囊殼吸濕可能使得內(nèi)容物顆粒團(tuán)聚，嚴(yán)重影響DPIs的吸入性能。研究表明，膠囊殼的水分含量會(huì)影響其軟硬程度和彈性，而明膠膠囊殼的含水量為12.5%～17.5%，在較高的相對(duì)濕度條件下容易吸濕軟化[17]。

由影響因素試驗(yàn)結(jié)果可知，SMMC-DPIs在高溫和強(qiáng)光條件下性質(zhì)穩(wěn)定，而在高濕環(huán)境中穩(wěn)定性較差，提示應(yīng)采用鋁塑泡罩包裝，并密封于干燥環(huán)境中貯存，推薦采用新型HPMC膠囊殼，其含水量僅為2%～7%，在較寬的相對(duì)濕度(0%～75%)范圍內(nèi)均可保持正常外觀，不發(fā)生碎片等異常情況，抗?jié)衲芰︼@著優(yōu)于明膠膠囊[17]，更適合作為吸入制劑膠囊殼。

3.2 吸入粉霧劑加速穩(wěn)定性試驗(yàn)

加速穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。可見，SMMC-DPIs在(40±2)℃、(75±5)%RH的加速條件下貯存3個(gè)月后，膠囊殼完好，未見明顯變化，內(nèi)容物仍為白色疏松粉末，未見團(tuán)聚現(xiàn)象。但將內(nèi)容物從膠囊殼中傾倒出來時(shí)，可發(fā)現(xiàn)有極少量細(xì)粉黏附于膠囊殼內(nèi)壁上，貯存3個(gè)月后吸濕增重百分率為(1.97±0.31)%，符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定。此外，DPIs的DD和FPD與0月樣品間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其ED雖隨貯存時(shí)間延長略有下降(P<0.05)，但均大于90%，符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定[11]。從圖3A可見，供試樣品的APSD值在NGI各級(jí)分布基本不變，說明3個(gè)月內(nèi)樣品吸入性能未發(fā)生變化，可初步認(rèn)為制劑在加速穩(wěn)定性3個(gè)月試驗(yàn)中穩(wěn)定，符合《中國藥典》的規(guī)定[11]。

表1 影響因素試驗(yàn)結(jié)果

A.高溫條件(60 ℃)； B.強(qiáng)光條件[(4 500±500) lx]； C.高濕條件[(75±5)%RH]

表2 加速和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 吸入粉霧劑長期穩(wěn)定性試驗(yàn)

長期穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。可見，SMMC-DPIs在(25±2)℃、(60±10)% RH條件下貯存3個(gè)月后膠囊殼完好，未見軟化變形，內(nèi)容物仍為白色疏松粉末，未見團(tuán)聚或變色，吸濕增重百分率為(1.45±0.21)%，DD、ED和FPD也未發(fā)生顯著變化(P>0.05)，從圖3B可見APSD值也基本不變，說明3個(gè)月內(nèi)樣品吸入性能未發(fā)生變化，可初步認(rèn)為制劑在長期穩(wěn)定性3個(gè)月試驗(yàn)中穩(wěn)定，符合《中國藥典》相關(guān)規(guī)定[11]。

在鋁塑泡罩包裝條件下樣品加速和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，SMMC-DPIs在貯存3個(gè)月后，膠囊殼未出現(xiàn)軟化現(xiàn)象，DD間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，ED和FPD符合《中國藥典》規(guī)定[11]，吸入性能基本不變，說明SMMC-DPIs在加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)中穩(wěn)定性良好，可長期貯存，有望應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。但由于研究時(shí)間所限，加速穩(wěn)定性試驗(yàn)和長期穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)僅收集到3個(gè)月，后續(xù)將繼續(xù)考察其6、9、12、18、24個(gè)月的長期穩(wěn)定性試驗(yàn)，為制定SMMC-DPIs的有效期提供更多依據(jù)。

A.加速穩(wěn)定性試驗(yàn)； B.長期穩(wěn)定性試驗(yàn)。

藥物制劑穩(wěn)定性是制劑研究、開發(fā)與生產(chǎn)中的關(guān)鍵[18]。若DPIs的穩(wěn)定性在生產(chǎn)、運(yùn)輸和貯存過程中發(fā)生改變，可能影響到DPIs的肺部有效沉積率，進(jìn)而導(dǎo)致藥效降低甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)。對(duì)于DPIs而言，載體可改善DPIs的流動(dòng)性、分散性從而提高肺部藥物遞送效率，是提高制劑療效的關(guān)鍵組成，也是影響制劑穩(wěn)定性的重要因素，本研究可為后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)提供相關(guān)理論依據(jù)。