松材線蟲對長白落葉松的致病性*

曹業凡 汪來發 王曦茁 范結紅

(1.中國林業科學研究院森林生態環境與保護研究所 國家林業和草原局森林保護學重點實驗室 北京 100091； 2.安徽省望江縣林業局 望江 246200)

長白落葉松(Larixolgensis)是我國東北部山地主要用材樹種，在遼寧省部分地區分布廣泛。生長速度快，木材材質好，干型通直，耐旱性與抗澇性強，對地方的水源涵養、水土保持以及生態系統保護具有重大作用(聶大光， 2015)，常被用于工程建設與工業造紙(胡曉晴， 2016)。截至2000年，長白落葉松占人工造林總面積10%，蓄積量占我國木材總蓄積量7.8%(Pengetal., 2009)。因此，長白落葉松對我國北方地區林業建設意義重大。

松材線蟲病(pine wilt disease)，是一種以松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)為病原，墨天牛屬(Monochamus)昆蟲為媒介的系統性病害(葉建仁， 2010； 2019； Futai， 2013)，主要危害松科植物，目前該病害已蔓延擴散至中國、日本和韓國等多個國家(Wangetal.， 2010； Abelleiraetal.， 2011； Shinyaetal.， 2013)。據國家林業和草原局2019年4號和14號公告統計，目前我國大陸地區松材線蟲病縣級疫區數為634個，新增縣級疫區327個，且病情由南向北不斷蔓延擴散，形勢嚴峻。目前松材線蟲所危害的植物寄主大部分為松屬(Pinus)，因此關于松材線蟲對黑松(P.thunbergii)、赤松(P.densiflora)與馬尾松(P.massoniana)及其他松屬植物致病性的研究較多(金鋼等， 2007； 朱麗華等， 2017； 林麗等， 2017； Maeharaetal., 2011； Akibaetal.， 2012)，關于松材線蟲對落葉松屬樹種的致病性研究較少。已有研究表明，松材線蟲對美國西部落葉松(L.occidentalis)、日本落葉松(L.kaempferi)、歐洲落葉松(L.decidua)和美洲落葉松(L.laricina)均具有致病性(Futaietal.， 1989； Wingfield， 1982； Mamiyaetal.， 2009； 楊寶君等， 1993)。目前，在遼寧省枯萎的長白落葉松中已分離到松材線蟲(于海英等， 2019)，但關于松材線蟲對長白落葉松的致病性研究迄今沒有報道，其對長白落葉松的致病性尚未進行科赫氏法則驗證。為明確松材線蟲對長白落葉松的致病性，本研究以2年生長白落葉松幼苗為材料，接種不同株系松材線蟲，研究松材線蟲對長白落葉松的致病過程、松材線蟲在長白落葉松幼苗內的移動能力以及超氧化物歧化酶(SOD)活性變化，明確松材線蟲對長白落葉松的致病性，為長白落葉松松材線蟲病防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

松材線蟲株系號及其來源： 1)QH-1，采自遼寧省清原縣的感病紅松(P.koraiensis)； 2)NM-1，采自江蘇省南京市的感病馬尾松； 3)CM-1，采自重慶市的感病馬尾松。按常規方法分離純化和培養松材線蟲。

幼苗為2年生長白落葉松實生苗，培養于中國林業科學研究院內苗圃地，備用。

1.2 不同株系松材線蟲對長白落葉松致病性測定

2年生長白落葉松實生苗的致病性測定采用皮接法，每株系接種長白落葉松苗10株，接種量為每株2 000條，以無菌水接種為對照。接種后，于苗圃地內進行常規管理，持續觀察接種幼苗發病情況，統計松苗發病率。接種35天后，統計各株系松苗發病率，感病指數計算參照徐福元等(1994)并稍作改進。對所有植株分別進行線蟲分離與計數統計。

發病率=發病株數/接種株數×100%；

感病指數=∑(各級株數×各級代表數值)×100/調查總株數×發病最重級的代表數值。

1.2 不同株系松材線蟲的移動能力測定

接種方法同1.1。接種完成后，每隔1、2、4、7、10、15、25天進行取樣。 將接種幼苗整株拔出，用流水輕輕沖洗干凈，以接種部位為參照，用快刀片截取材料，自接種部位上、下1.5 cm處開始，每隔1 cm切取1 cm莖段用于分析樣品將截取莖段取下放入10 ml離心管中，加入10 mL水。在室溫下靜置一天后，以1 500 r·min-1的轉速離心3 min，吸去上清液，經鏡檢統計不同時間段內不同部位的松材線蟲的數量，以“+”表示接種點上方，“-”表示接種點下方。

1.3 SOD活性測定

接種方法參照1.1，依次于接種后1～7天定時進行葉片取樣，取樣位置為接種點附近。取樣后將樣品置于液氮預冷后，存于-80 ℃冰箱備用。SOD活性測定(WST-8法)試劑盒由蘇州科銘生物技術有限公司提供，測定方法參照試劑盒說明書。

1.4 接種后長白落葉松橫切面變化情況觀察

接種方法參照1.1。接種完成后，每隔1、2、4、7、10、25天于接種點下方1.5 cm處截取莖段，在解剖鏡下觀察莖段橫截面變化，拍照并記錄。

1.5 數據統計與分析

將數據導入SPSS20.0軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同株系松材線蟲對長白落葉松的致病性

接種試驗表明，QH-1、NM-1與CM-1株系松材線蟲均能使2年生長白落葉松幼苗枯萎發病(表1)。感病初期，接種點附近針葉出現失水萎蔫癥狀；感病中期，整株針葉褪綠變淺色，但并未變黃； 感病后期，整株針葉枯萎變紅，當年生嫩枝開始掉落，此時幼苗已枯萎死亡。

病程記錄表明，不同株系松材線蟲接種長白落葉松后的首次發病時間與致病進程存在明顯差異。接種QH-1的幼苗第10天時針葉開始出現失水萎蔫，第15天時出現針葉褪綠，第20天時針葉枯萎變紅； 而接種NM-1與CM-1的幼苗于15天左右才開始出現早期發病癥狀，25天時針葉出現枯萎變紅。發病率統計結果表明，接種5周后，接種QH-1的長白落葉松幼苗發病率為100%，接種NM-1與CM-1的發病率分別為70%與60%。感病指數統計結果表明，接種QH-1株系松材線蟲2年生長白落葉松幼苗感病指數為100，接種NM-1與CM-1的長白落葉松幼苗感病指數分別為43.3與40。

接種35天后萎蔫植株中的再分離線蟲量表明(表1)，在接種QH-1、NM-1與CM-1后枯萎發病的長白落葉松幼苗內均能分離到松材線蟲，在接種QH-1后枯萎的長白落葉松幼苗平均每株分離的線蟲量為(2 3457±2 862)條，而接種NM-1與CM-1后枯萎的長白落葉松幼苗平均每株分離的線蟲量分別為(14 090±2 190)條和(15 857±2 079)條，數量差異顯著(P<0.01)，結合病害進程記錄可知，線蟲再分離數量越大，長白落葉松幼苗發病癥狀越嚴重。對接種NM-1與CM-1后并未枯萎發病的2株長白落葉松幼苗進行線蟲分離，其中接種NM-1后的未發病幼苗所含線蟲分別為32條和0條，接種CM-1后的未發病幼苗所含線蟲分別為24條和103條。

2.2 不同株系松材線蟲的移動能力與癥狀變化

不同株系松材線蟲在接種幼苗不同莖段內的分布數量隨接種時間變化而增加，發病癥狀隨線蟲數量增加而加重(表2)。

將QH-1接種長白落葉松幼苗后，1天時接種點上方1～2 cm處分離到少量線蟲，接種點下方線蟲已移動至5 cm處，此時接種幼苗無明顯癥狀(圖1A)。4天時在接種點上方4～5 cm處分離到少量線蟲，接種點下方8 cm分離到少量線蟲，此時接種幼苗的當年嫩枝出現部分失水萎蔫癥狀(圖1B)。7天時線蟲已移動至接種點上方8 cm處，接種點下方線蟲數量增加，此時接種幼苗的接種點附近針葉開始萎蔫，但并未褪綠變黃。10天時接種點上方與下方線蟲數量已超過1 000，梢頭及主干最低處均分離出少量線蟲，接種幼苗整株萎蔫，針葉褪綠變淺，頂梢及部分當年嫩枝枯萎變褐(圖1C)。15天時接種點附近線蟲總數量已超過接種量，接種幼苗萎蔫癥狀加重，枯萎針葉開始脫落，整株當年嫩枝枯萎變褐(圖1D)。20天時線蟲數量開始減少，此時接種幼苗完全死亡，整株針葉變紅并極易脫落，所有嫩枝萎蔫加重并開始脫落(圖1E)。25天時線蟲數量再次減少，接種點上、下方僅有極少量線蟲分布，接種幼苗與20天時相比無明顯變化。

將CM-1接種長白落葉松幼苗后，1天時接種點上方無線蟲分離，接種點下方線蟲已移動至2 cm處，線蟲數量極少，此時接種幼苗無明顯癥狀(圖1A)。2天時在接種點上方仍然無線蟲分布，接種點下方線蟲未向下移動擴散，接種幼苗無明顯癥狀。4天時在接種點上方2 cm處有線蟲分布，接種點下方3 cm處有線蟲分布，接種幼苗無明顯癥狀。7天時線蟲已移動至接種點上方3 cm處，接種點下方線蟲數量增加，并移動至4 cm處，部分接種幼苗的當年嫩枝出現失水萎蔫癥狀，針葉無明顯變化(圖1B)。10天時接種點附近線蟲數量開始增加，此時接種幼苗頂梢及部分當年嫩枝出現失水萎蔫癥狀，但并未枯萎，針葉無明顯變化。15天時線蟲開始進一步移動擴散，接種點上方7 cm與下方8 cm處均可分離到少量線蟲，接種幼苗接種點附近針葉出現萎蔫癥狀，頂梢及部分當年嫩枝萎蔫加重(圖1C)。20天時接種點上方與下方線蟲數量超過1 000，梢頭及主干最低處均分離出少量線蟲，此時接種幼苗整株萎蔫，頂梢及部分當年嫩枝枯萎程度加重(圖1D)。25天時線蟲數量已超過接種量，接種幼苗萎蔫癥狀加重，枯萎針葉開始脫落，整株當年嫩枝枯萎變褐(圖1E)。

NM-1接種長白落葉松幼苗后，其前期1～7天擴散分布趨勢和外部形態變化與接種CM-1的長白落葉松幼苗基本一致，線蟲數量較少，無明顯癥狀(圖1A)。10天時線蟲移動至接種點上方5 cm與下方6 cm處，接種幼苗部分嫩枝出現萎蔫癥狀，針葉無明顯變化(圖1B)。15天時線蟲移動擴散至樹體遠端，接種點上方8 cm與下方8 cm處均可分離到少量線蟲，接種幼苗接種點附近針葉出現萎蔫癥狀，頂梢及部分當年嫩枝萎蔫加重(圖1C)。20～25天內接種幼苗的枯萎癥狀加重，針葉褪綠變紅，整株當年嫩枝枯萎變褐，25天時線蟲數量已超過接種量(圖1D)。

圖1 接種松材線蟲后的長白落葉松外部病狀Fig. 1 External symptoms of the L. olgensis after inoculated with B. xylophilusA: 無病癥No symptoms； B:第1階段The 1 phase； C: 第2階段The 2 phase； D: 第3階段The 3 phase； E: 第4階段The 4 phase.

2.3 接種后長白落葉松SOD活性變化結果

長白落葉松在接種不同株系松材線蟲后，SOD活性均發生變化，但變化幅度存在部分差異。SOD活性變化結果表明，接種1天后QH-1處理組幼苗SOD活性出現持續下降(圖2)，下降百分比為36.6%，NM-1與CM-1處理組無明顯變化。隨后2～4天內QH-1處理組幼苗維持較低SOD活性，而接種NM-1與CM-1株系松材線蟲的長白落葉松幼苗SOD活性無明顯變化。接種第5天后除對照組外，其他處理組幼苗SOD活性開始大幅度上升，直至第6天后SOD活性達到峰值，此時QH-1、NM-1與CM-1處理組幼苗SOD活性與CK組相比分別增長51.6%、38.1%與27.1%。接種第7天后，QH-1、NM-1與CM-1處理組幼苗SOD活性開始下降，下降幅度依次為63.9%、23.6%與10.3%。因此，長白落葉松幼苗接種QM-1、NM-1與CM-1株系線蟲后SOD活性變化幅度存在明顯差異。

圖2 接種不同株系松材線蟲后的長白落葉松SOD活性變化Fig. 2 Activity changes of SOD in L. olgensis after inoculated with three different isolates of pinewood nematode

2.4 接種后長白落葉松橫切面變化

接種QH-1后1～7天，長白落葉松幼苗的橫截面無明顯變化，此時髓部變化與松脂分泌量與對照組相同(圖3A)。接種10天后，長白落葉松幼苗髓部出現變化，髓心變褐并出現空洞，松脂道松脂分泌量減少(圖3B上)。接種25天后，髓心褐變加重，空洞化程度加劇，髓部已被完全破壞，樹脂道無樹脂分泌，此時幼苗整株已死亡(圖3B下)。

接種NH-1后長白落葉松幼苗的橫截面髓部與松脂分泌量在前期與對照組相同，接種10天后，長白落葉松幼苗髓部出現變化，髓心變褐并出現小空洞，松脂道松脂分泌量減少，與接種QH-1的長白落葉松幼苗相比癥狀較輕(圖3C上)。接種25天后，髓心褐變加重，部分髓部已被破壞，樹脂道無樹脂分泌，此時幼苗整株已死亡(圖3C下)。

表1 長白落葉松幼苗接種松材線蟲35天后的發病率、感病指數與再分離線蟲量①Tab.1 Morbidity and disease-infected index of 2-year-old L. olgensis seedlings inoculated with pine wood nematode and population densities of nematodes(35 d after inoculation)

接種CM-1后長白落葉松幼苗的橫截面髓部與松脂分泌量在前期與對照組相同，接種10天后長白落葉松幼苗髓部出現變化，髓心變褐并出現空洞，松脂道松脂分泌量減少，與接種NM-1的長白落葉松幼苗相比癥狀較重(圖3D上)。接種25天后，髓心部分已被破壞，樹脂道無樹脂分泌，此時幼苗整株已死亡(圖3D下)。

圖3 接種不同株系松材線蟲后的長白落葉松橫切面變化(接種點以下1.5 cm)Fig. 3 The cross section of L. olgensis 1.5 cm downwards distant from inoculation dot with three different isolates of pinewood nematodeA：無菌水對照(接種10天后)；B：QH-1株系(接種10天后)； C：NM-1株系(接種10天后)； D：CM-1株系(接種10天后)；E：無菌水對照(接種25天后)；F：QH-1株系(接種25天后)；G：NM-1株系(接種25天后)； H：CM-1株系(接種25天后)。圖中比例尺為500 μm。A：CK(sterile water)(10 d after inoculation); B：QH-1 isolates (10 d after inoculation); C：NM-1 isolates (10 d after inoculation); D：CM-1isolates (10 d after inoculation)；E：CK(sterile water)(25 d after inoculation)；F：QH-1 isolates (25 d after inoculation)；G：NM-1 isolates (25 d after inoculation)； H：CM-1 isolates (25 d after inoculation)。Scale in the picture is 500 μm.

3 討論

松材線蟲的寄主植物分布廣泛，包括自然感病寄主與人工接種感病寄主在內共計106種松科植物，其中大部分屬于松屬，落葉松屬感病寄主較少(葉建仁， 2010； 王曦茁等， 2018； 于海英， 2019)。近年來松材線蟲病在我國逐漸由南向北傳播蔓延，已有從紅松枯木內發現云杉花墨天牛(M.saltuarius)與松材線蟲(于海英等， 2018； 潘龍等， 2019)的報道。相關研究表明云杉花墨天牛對日本落葉松具有一定取食傾向(潘佳亮， 2019)，但尚無媒介昆蟲對長白落葉松的取食傾向研究的報道。因此，關于長白落葉松松材線蟲病的傳播途徑，還需進一步研究。

表2 不同株系松材線蟲接種長白落葉松幼苗后線蟲的分布與數量Tab.2 The distribution and number of nematode in L. olgensis seedlings after inoculated with three isolates of pinewood nematode

本研究通過對2年生長白落葉松幼苗進行不同株系松材線蟲的接種試驗，發現不同株系松材線蟲對長白落葉松的致病性存在明顯差異，這可能與松材線蟲的地理來源、寄主植物、寄主樹齡與飼喂菌株均有一定關系(胡凱基等， 1994； 張治宇等， 2002； 楊寶君等， 1993； 瞿紅葉等， 2009)。本研究中所選松材線蟲其地理來源與寄主植物分別為清原-紅松、南京-馬尾松與重慶-馬尾松，其他條件相同，因此本研究中不同株系的松材線蟲對長白落葉松的致病性存在差異，可能與地理分布與寄主植物有關，而其致病性差異的產生機制，有待進一步研究。

不同致病力松材線蟲之間的生物學特性也存在差異，主要反映在繁殖力與移動能力(Ichiharaetal.， 2000； Kiyoharaetal.， 1990)，一般認為強致病力株系的松材線蟲其繁殖力、移動能力均高于弱致病力株系，因此強致病力株系能夠更快導致寄主植物發病并枯萎死亡，但也有部分學者認為松材線蟲的繁殖力與移動能力與其致病力無明顯關系(Togashietal.， 2003)。本研究中QH-1對長白落葉松的致病性最強，移動能力與繁殖能力最高，且接種后發病時間最快，CM-1與NM-1對長白落葉松也具有致病性，但移動能力與繁殖能力低于QH-1，接種后發病時間比QH-1慢，因此本研究中松材線蟲對長白落葉松的致病性與移動能力與繁殖能力呈正相關性。

逆境能夠誘導植株產生SOD、POD與CAT等抗氧化酶(Bowler， 1992)，從而起到保護作用。謝婉鳳等(2018)通過接種試驗發現隨著病程加重，接種植株SOD活性呈先升高后下降的趨勢，這與陳玉惠等(2002)研究結論相似。徐華潮等(2012)通過對20年生自然感病馬尾松與黑松進行SOD活性變化研究，發現隨著病程加重，SOD活性持續下降。本研究中接種QH-1的長白落葉松幼苗SOD活性在接種后1～4天呈下降趨勢，此時CM-1與NM-1處理組SOD活性無明顯變化，表明發病前期QH-1對長白落葉松內部細胞破壞更嚴重，因此SOD活性下降。接種后5～7天，所有處理組SOD活性均呈先升高后下降的變化趨勢，但變化幅度存在明顯差異，其中QH-1處理組變化幅度最大，表明QH-1對長白落葉松內部生理活動破壞最為嚴重。

本研究通過對接種CM-1與NM-1但并未表現病癥的幼苗進行線蟲分離，發現這些幼苗中存在少量線蟲，這與張治宇等(2002)和林麗等(2017)研究結果相符，表明部分接種植株對CM-1與NM-1可能存在一定抗性，因此少量線蟲無法導致接種植株萎蔫發病。如果帶蟲植株樹勢衰弱導致其抗病性降低，就有可能使得線蟲繼續繁殖侵染，導致松樹萎蔫死亡。因此攜帶松材線蟲未表現癥狀的植株可能會傳播松材線蟲病，該病害傳播因素必須引起重視。

4 結論

本研究以2年生長白落葉松幼苗為材料，通過接種不同株系的松材線蟲，證明QH-1、NM-1與CM-1對長白落葉松均有致病性，其中QH-1致病性最強，NM-1與CM-1無明顯差異，至于松材線蟲對2年生和其他齡級長白落葉松的致病性有何差異，有待進一步研究。