毛果楊NAC128基因在次生壁形成中的功能*

李 媛 陳金煥 金 曌 侯景丫 姜玉松 邢海濤

(1. 重慶文理學院 經濟植物生物技術重慶市重點實驗室 重慶 402168；2. 北京林業大學 林木分子育種高精尖創新中心 北京 100083)

木材是木本植物最重要的可再生資源,不僅廣泛用于建筑、家具生產和造紙業，而且是生物質能源的重要來源。次生壁是木材的主要成分，主要由木質素、纖維素、半纖維素以及少量的結構蛋白和酶構成。次生壁的積累由次生壁組分合成基因和轉錄因子共同調控(Taylor-Teeplesetal., 2015)。因此，解析次生壁物質形成中的關鍵調控因子及其作用機制，可為利用分子生物學手段提高木材的生長速率和產量，改良木材品質提供理論基礎。

轉錄因子是一類重要的調控因子，一般通過結合特異的順式作用元件從而激活或抑制下游基因的轉錄，從而參與植物的生長發育和抗性響應等生物學過程。NAC (NAM, ATAF1/2 和CUC2)是植物特有的且最大的轉錄因子家族之一。隨著高通量測序技術的發展，越來越多的植物NAC基因被發掘和鑒定，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻(Oryzasativa)、大豆(Glycinemax)、毛果楊(Populustrichocarpa)和毛竹(Phyllostachysedulis)中分別鑒定出117、151、152、163、93個NAC家族成員(Nuruzzamanetal., 2010; Huetal., 2010； Sunetal., 2018; Shanetal., 2019)。NAC 轉錄因子在 N 端含有1個約160個氨基酸殘基大小的保守區域，該保守區域被進一步細分為 A、B、C、D、E 5個亞結構域，亞結構域C、D序列中含有核定位信號, 可能與轉錄因子核定位及啟動子上特定順式元件的識別有關(Aidaetal.,1997; Ookaetal., 2003)； 高度變異的C端序列存在轉錄調控域，激活或抑制靶基因的轉錄，C端序列的多變與NAC蛋白功能的多樣化密切相關(Duvaletal., 2002; Hegedusetal., 2003; Jensenetal., 2010)。

在植物中，NAC轉錄因子參與調控植物的生長發育和激素信號轉導(Parketal., 2011; Wangetal., 2015; Kimetal., 2016)，同時也參與植物各類生物和非生物脅迫應答過程(孫利軍等， 2012)。在水稻中，過表達OsNAC5基因顯著增強了抗旱性(Jeongetal., 2013)。在擬南芥中，NAC1能夠介導生長素信號，促進側根發育(Guoetal., 2005)；CUC1和CUC2參與器官邊界建成和分生組織的形成(Aidaetal.,1997)。Tran等(2004)從擬南芥中分離的3個NAC基因 (ANAC019、ANAC055和ANAC072)均受干旱脅迫誘導表達, 過表達這些NAC基因能顯著提高植株的耐旱能力。NAC基因家族在次生壁形成中也發揮了關鍵調控作用。近幾十年來研究表明，NAC轉錄因子作為植物細胞次生壁合成的第1級主開關, 能夠激活一系列下游轉錄因子和次生壁組分合成基因的表達(李慧等， 2020)。擬南芥SND1不僅可以直接誘導木質素合成基因PAL1、CCoAOMT和4CL3的表達, 以及半纖維素合成基因IRX9、纖維素合酶類基因CSLB02、阿拉伯半乳糖蛋白基因FLA12的表達，而且能夠激活MYB46基因的表達, 誘發次生壁相關基因的高度上調表達, 促進纖維素、木聚糖、木質素在細胞次生壁的沉積(Zhongetal., 2007; 2011a； Ohashi-Itoetal., 2010)。擬南芥NST1和NST2調控花藥開裂所必需的花藥內皮層細胞的次生壁增厚(Mitsudaetal., 2007)； 同時,NST2也參與莖稈纖維細胞次生壁合成的調控，nst1nst2nst3/snd1三突變體植株纖維細胞次生壁完全缺失, 表明NST2、NST1以及NST3/SND1協同調控纖維次生壁的合成(Zhongetal., 2015)。楊樹基因PtrWNDs在擬南芥中的異源表達可以恢復snd1nst1雙突變體的表型,PtrWNDs的過表達引起次生壁合成基因的表達上調(Zhongetal., 2010； 2011b; Ohtanietal., 2011), 在PtrWNDs表達量下降的轉基因楊樹中, 木質部導管和纖維細胞的次生壁加厚受到抑制(Zhongetal., 2011b)。上述研究表明，NAC轉錄因子在調控植物次生壁形成過程中發揮重要作用，因而對NAC轉錄因子的分離和鑒定將有助于解析植物細胞次生壁形成機制。

2006年完成了毛果楊全基因測序(Tuskanetal., 2006)，并建立了穩定的遺傳轉化體系，因此，以楊樹為模式樹種，解析次生壁形成的調控網絡將為林木定向育種奠定重要理論基礎。目前，次生壁合成的關鍵酶基因已經基本克隆出來并進行了功能分析，但其轉錄層面的研究仍有待完善。Hu等(2010)研究表明，毛果楊NAC基因家族包含163個成員，其中14個PtrNACs基因特異地在發育中的木質部高表達。本研究通過轉錄組分析，篩選到1個在毛果楊木質部高表達的基因PtrNAC128并分離出基因全長序列，通過生物信息學軟件分析該基因的結構及進化，利用qRT-PCR分析PtrNAC128在不同組織中的表達差異； 利用農桿菌介導法將PtrNAC128導入毛白楊(Populustomentosa)中進行功能分析。本研究將有助于在轉錄調控層面揭示木質素合成調控機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及試劑

試驗材料為毛果楊、毛白楊組培苗及溫室培養苗、煙草 (Nicotianabenthamiana) 幼苗。AxyPrep PCR清潔試劑盒、AxyPrep質粒DNA小量試劑盒、AxyPrep膠回收試劑盒采購自AXYGEN公司。PCR高保真酶購自大連寶生物科技有限公司；XcmⅠ 限制性內切酶購自NEB公司； Peasy-T1、大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態細胞、根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)GV3101感受態細胞均購自全式金生物有限公司。DAPI、CM-Dil 染色劑購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 毛果楊PtrNAC128 基因的克隆和序列分析

根據Hu等(2010)關于毛果楊NAC轉錄因子基因家族的報道，獲得PtrNAC128基因ID (Potri.006G152700.1)，并在Phytozome網站下載PtrNAC128基因序列。根據PtrNAC128基因序列，設計引物(表1)，以毛果楊葉cDNA為模板，PCR擴增獲得該基因，并連接到Peasy-T1載體，測序驗證所克隆的PtrNAC128基因序列。分別使用在線軟件Gene Structure Display Server 2.0 和MEME分析PtrNAC128基因結構和基序(Motif)。使用MEGA X對已知參與調控木質部生長發育的NAC結構域蛋白構建系統進化樹。

1.3 PtrNAC128基因的qRT-PCR分析

毛果楊組培苗經煉苗后，移植于10 cm×10 cm×15 cm容器中，1個月后移植入大盆內，室外培養。生長6個月后，取其嫩葉(頂芽下第2片葉)、老葉(頂芽下第7片)、嫩莖(第2節間)、老莖(第6節間)和根，迅速清洗材料表面，用濾紙吸凈表面水分后液氮凍存。提取總RNA、反轉錄獲得cDNA模板。以Pto18S為內參基因，設計特異性引物(表1)，以各組織cDNA為模板，進行qRT-PCR反應。qRT-PCR 反應條件為： 95 ℃預變性30 s; 95 ℃變性5 s, 60 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s，40個循環。生物學重復3次，技術重復5次。基因表達量分析采用2-△△Ct法 (Livaketal., 2001)。利用SPPSS軟件分析顯著差異，用GraphPad Prism 5軟件作圖。

1.4 PtrNAC128基因植物過表達載體的構建及毛白楊遺傳轉化

利用在線軟件DNAMAN分析PtrNAC128基因CDS區域的酶切位點，設計含BglⅡ、SpeⅠ的上下游引物(表1)，構建35S∷PtrNAC128-GFP重組載體，經菌檢、測序驗證。轉化至農桿菌GV3101，參照Li等(2018)方法進行毛白楊遺傳轉化。經誘導愈傷、分化生芽、生根形成完整轉基因植株。煉苗后移至室外培養。提取轉基因植株葉片總RNA，用潮霉素篩選標記特異性引物，進行陽性植株PCR鑒定。

1.5 亞細胞定位分析

將1.4中構建的35S∷PtrNAC128-GFP重組載體，以及攜帶35S∷GFP未重組載體為對照，參照寧波新芝公司高壓氣體基因槍GJ-1000的操作手冊，在煙草葉片中進行瞬時表達，再在熒光顯微鏡下觀察，同時用核染料DAPI染細胞核，利用激光共聚焦熒光顯微鏡觀察熒光信號，明確PtrNAC128在細胞中的位置。

1.6 毛白楊莖橫切面解剖觀察

取毛白楊野生型及轉基因植株莖的第6節間，制作石蠟切片，滴加甲苯胺藍染色，之后在解剖鏡下觀察，藍色部分即為木質素沉積的部分。

1.7 次生壁組分含量測定

1.7.1 木質素含量測定 參照 Jung 等(1999)和Dence(1992)分別測定Klason 木質素和酸溶木質素含量。取生長6個月的野生型和PtrNAC128過表達的毛白楊莖部作為材料，烘干后研磨成粉，過40目篩，稱取材料0.2 g，隨后用苯∶乙醇(體積比2∶1)抽提8 h，將風干的材料轉移至質量分數72%的濃硫酸(3 mL)中， 20 ℃ 2 h，用蒸餾水定容至100 mL，121 ℃ 1 h，最后，105 ℃干燥12 h。采用重力法測定酸不溶木質素含量，濾液中酸溶木質素在205 nm波長下檢測。參照Liyama 等(1988)，采用乙酰溴法測定總木質素。

1.7.2 纖維素及半纖維素含量測定 纖維素及半纖維素的含量參考Van Soest等(1967)方法測定。

1.8 次生壁組分合成關鍵酶基因及轉錄因子的表達分析

取野生型和PtrNAC128過表達(PtrNAC128-OE)毛白楊組培苗嫩莖，提取總RNA、反轉錄獲得cDNA模板。利用qRT-PCR 分析木質素合成途徑關鍵酶基因(CAD1、C3H3、COMT2、C4H2、CCoAOMT1、CSE1、HCT1、F5H2、CCR2、PAL1和4CL5)、纖維素合成酶基因(CesA7-A和CesA4)和半纖維素合成酶基因(GT8D、GT43B和GT43D)的表達差異(Shietal., 2010; Vanholmeetal., 2013； Songetal., 2010； Leeetal., 2011)。另外，對參與調控次生壁組分合成的已知NAC、MYB 轉錄因子(MYB028、MYB090、MYB152、MYB161、MYB168、MYB175、MYB192、NAC105、NAC154和NAC156) 在不同株系中的表達情況進行分析(Lietal., 2018)。qRT-PCR同1.3，引物見表1。

2 結果與分析

2.1 毛果楊PtrNAC128基因克隆及結構分析

毛果楊PtrNAC128基因，轉錄本長度2 379 bp，ORF長度1 374 bp，編碼蛋白457個氨基酸(圖1A)，包含6個外顯子(圖1B)，分子量51.47 kDa，A. PtrNAC128與擬南芥同源基因的氨基酸序列比對(深藍色代表完全一致氨基酸序列，上劃線代表NAC 保守結構域); B.PtrNAC128基因結構分析； C. PtrNAC128氨基酸序列保守模塊預測； D. PtrNAC128與其他參與調控次生壁發育的NAC蛋白系統進化樹分析。Ptr: 毛果楊; Os: 水稻; Zm: 玉米; Eg: 巨桉; 其余為擬南芥。A. Multiple sequence alignment between PtrNAC128 and the 3 homologes ofArabidopsis(Identical amino acids are shaded in dark blue, the conserved NAC domain are overlined); B. Gene structure ofPtrNAC128; C. Structure of PtrNAC128 protein potential motifs; D. Phylogenetic analysis of PtrNAC128 and other NAC proteins by the neighbor-joining method using MEGA version X. Ptr:Populustrichocarpa; Os:Oryzasativa; Zm:Zeamays; Eg:Eucalyptusgrandis; Others：Arabidopsisthaliana.

表1 引物序列Tab.1 List of primers

圖1 PtrNAC128與其他物種NAC蛋白序列的比較Fig.1 Comparison of PtrNAC128 with other NAC amino acid sequences

等電點(pI)6.51。在線軟件Pfam scan分析PtrNAC128蛋白結構域的結果表明，PtrNAC128蛋白N端(48—189 aa) NAC保守結構域包含A、B、C、D 4個亞結構域(圖1A)。MEME 的分析表明PtrNAC128蛋白含有10個較為保守的Motif，均勻分布在蛋白序列間，沒有聚集分布特征(圖1C)。搜集已知物種中參與調控木質部發育的NAC 家族氨基酸序列構建系統發育進化樹(圖1D)，結果顯示，PtrNAC128與擬南芥NAC075、SND2、SND3在同一支。PtrNAC128與擬南芥NAC075氨基酸序列相似性是63.69%，且主要集中在N端，C端差異明顯。這些結果表明，PtrNAC128在DNA結合區具有較強的保守性，但其激活區在進化上具有較大的差異。

2.2 PtrNAC128基因的組織表達分析

取室外培養6個月的毛果楊扦插苗的根、嫩莖、老莖、嫩葉、老葉樣品，提取RNA,進行PtrNAC128基因的qRT-PCR分析(圖2)。PtrNAC128基因在根、莖、葉中均有表達。在嫩葉中表達量最低； 老莖中表達量最高，老莖和嫩莖中的基因表達量分別約為嫩葉中的23.49倍和11.44倍。

圖2 PtrNAC128 組織特異性表達模式分析Fig.2 Expression patterns of PtrNAC128 in different tissues of poplar采用t檢驗，*表示差異顯著(P < 0.05)，**表示差異極顯著(P < 0.01)。The single and double stars indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels of the gene expression in different tissues according to Student’s t-test.

圖3 PtrNAC128亞細胞定位分析Fig.3 Subcellular localization analysis of PtrNAC128熒光共聚焦顯微鏡追蹤PtrNAC128-GFP定位在細胞核內，對照組顯示自由GFP均勻分布在細胞核和細胞膜上。DAPI為細胞核染料。Confocal images of localization of PtrNAC128-GFP in tobacco(Nicotiana benthamiana) leaf epidermal cells. Bright field and fluorescent micrographs show the nuclear localization of PtrNAC128-GFP and free GFP expressed both in nuclear and cytomembrane localization in tobacco leaf epidermal cells. DAPI (40, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride), a nuclear staining dye.

2.3 亞細胞定位分析

利用基因槍法將35S∷PtrNAC128-GFP重組載體在煙草表皮細胞瞬時表達，進行亞細胞定位(圖3)。結果表明，與對照相比，PtrNAC128蛋白集中分布在細胞核內，表明其編碼核定位蛋白。

圖4 過表達PtrNAC128對毛白楊次生木質部的影響Fig.4 Effects of PtrNAC128 overexpression on secondary xylem of Populus tomentosa stems標尺 Scale bars A: 5 cm; D, E, F: 50 μm; G, H, I: 20 μm. A. 溫室培養6個月，野生型(WT)和過表達PtrNAC128代表性株系L6、L7(OE-L6、OE-L7)的表型； B.野生型和各轉基因材料(OE-L1-11)中PtrNAC128的相對表達量; C. 第6節間木質部寬度統計； D.野生型(WT)毛白楊第6節間莖橫切面； E、F分別為過表達PtrNAC128的OE-L6和OE-L7第6節間莖切片材料； G、 H、 I分別為D、E、F的局部放大圖。Ph: 韌皮部; Xy： 木質部; Ve: 導管; Xf: 木纖維。t 檢驗結果： *表示差異顯著(P < 0.05); **表示差異極顯著(P < 0.01)； 下同。A. Phenotypes of representative 6-month-old wild-type(WT) and transgenic lines(OE-L6 and OE-L7); B. The relative expression levels of PtrNAC128 in transgenic(OE-L1-11) and wild-type poplar; C. Xylem width of wild-type and PtrNAC128 overexpression lines (OE-L6 and OE-L7). D,E,F are stem sections from the 6th internode of wild-type(D) and transgenic plants OE-L6(E)and OE-L7(F); G, H, I are the enlarged view of red rectangular in D, E, F, respectively. Ph: Phloem; Xy： Xylem; Ve: Vessel; Xf： Xylary fiber. The single and double stars indicate significant difference at 0.05 and 0.01 levels according to Student’s t-test, the same below.

2.4 PtrNAC128 過表達載體的構建與遺傳轉化

構建35S∷PtrNAC128-GFP植物表達載體，通過葉盤法進行遺傳轉化，使PtrNAC128在毛白楊中過量表達。利用9 mg·L-1的潮霉素選擇壓力進行篩選，篩選出陽性植株。另外，通過qRT-PCR分析PtrNAC128表達情況，獲得PtrNAC128過量表達的陽性轉基因苗(圖4A、B)。

2.5 轉基因毛白楊植株表型分析

從營養生長發育過程看，過表達PtrNAC128毛白楊各株系與野生型相比沒有明顯差異(圖4A)。選取過表達株系L6和L7，進一步通過解剖對莖橫切面進行觀察。結果表明，過表達PtrNAC128較野生型的次生木質部顯著增厚，為野生型的1.42～1.51倍(圖4C-F); 木質部細胞層數增加，約為野生型的1.22～1.31倍(圖4G-I)。

2.6 木質部細胞次生壁中木質素、纖維素、半纖維素含量測定

毛白楊野生型植株木質素含量一般為189.7 mg·g-1, 過表達PtrNAC128各轉基因株系中Klason木質素含量為212.7～231.9 mg·g-1，較野生型增加12%～22%； 利用乙酰溴法也發現同樣的趨勢(表2)。在過表達PtrNAC128各轉基因株系中，半纖維素的含量未發現顯著差異。過表達PtrNAC128各株系纖維素的含量為476.4～511.5 mg·g-1，較野生型(443.6 mg·g-1)增加7.4%～13.1%(表2)。

表2 過表達PtrNAC128和野生型毛白楊次生壁組分含量分析①Tab.2 Secondary cell wall composition analysis of the stems in PtrNAC128 overexpression and wild-type P. tomentosa

圖5 次生壁組分合成關鍵酶基因的表達Fig.5 Gene expression analysis of secondary wall biosynthetic genes

2.7 木質部細胞次生壁組分關鍵合成酶基因及轉錄因子的表達檢測

為了探究PtrNAC128調控次生壁各組分合成的分子機制，利用qRT-PCR，對木質素、纖維素和半纖維素合成途徑的關鍵酶基因的表達差異進行分析。結果表明，木質素合成途徑酶基因(PtoCAD1,PtoC3H3,PtoCOMT2,PtoC4H2,PtoCCoAOMT1,PtoCSE1,PtoHCT1,PtoF5H,PtoCCR2,PtoPAL1,Pto4CL5)表達水平均有顯著提高； 纖維素合成酶基因(PtoCesA7-A和PtoCesA4)表達量提高1.57～2.7倍； 而半纖維素合成酶基因(PtoGT8D,PtoGT43B和PtoGT43D)沒有明顯的變化(圖5)。

MYB、NAC轉錄因子在調控木質素和纖維素的生物合成過程中發揮重要作用。用qRT-PCR檢測毛白楊植株中可能參與調控木質素、纖維素合成的轉錄因子(PtoMYB028、PtoMYB090、PtoMYB152、PtoMYB161、PtoMYB168、PtoMYB175、PtoMYB192、PtoNAC105、PtoNAC154、PtoNAC156)表達情況。結果表明，PtoMYB028、PtoMYB152、PtoMYB161、PtoMYB192、PtoNAC105、PtoNAC156在過表達PtrNAC128各株系中均顯著上調(圖6)。這表明，PtrNAC128通過激活木質素和纖維素相關調控因子的表達，影響木質部次生壁各組分的合成。

圖6 次生壁組分合成相關轉錄因子的表達Fig.6 Gene expression analysis of secondary wall-associated transcription factors

3 討論

木材形成是一個極其復雜的過程。高等植物在長期適應陸地生境中，進化出一套精細調控細胞次生壁組分的生物合成途徑。次生壁各組分的生物合成關鍵酶基因已經分離并進行了功能鑒定，在轉錄調控層面也取得了一定進展。研究表明，在擬南芥中，NAC和MYB轉錄因子分別作為第1級和第2級主開關, 共同激活下游轉錄因子和次生壁物質合成基因的表達(Zhongetal., 2014; Nakanoetal., 2015)。SND1是激活次生壁物質合成途徑的主要轉錄開關。SND1不僅直接激活MYB46,MYB83,MYB103，SND3和KNAT7, 而且還調控SND2,MYB85,MYB52,MYB54,MYB69,MYB42,MYB43和MYB20等轉錄因子的表達 (Zhongetal., 2009)。NST1和NST3也是調節次生壁加厚的重要轉錄因子。nst1和nst3雙突變體植株中次生壁增厚和纖維細胞中木質素的沉積受到抑制, 植株呈現倒伏的表型(Mitsudaetal., 2007)。在木本植物中，也存在類似的NAC-MYB轉錄調控網絡。毛果楊PtrVNS1-16均包含NAC保守結構域，其中PtrVNS1-12在木質部中表達，這些基因不僅在序列上與擬南芥SND1存在相似性，而且在功能上也高度同源。過量表達這些基因均能夠導致次生壁增厚(Ohtanietal., 2011)。盡管在模式植物中，對于次生壁各組分的生物合成已經進行較為深入的研究，但其木質素和纖維素合成的精細調控框架中仍存在許多未知途徑有待完善。Hu等(2010)通過對毛果楊不同組織的表達譜進行分析，發現PNAC085、PNAC128等13個NAC基因特異地在發育中的木質部中高表達。本研究發現，PtrNAC128在木質部發育較為活躍的莖中表達量較高，尤其是老莖中表達量最高，與Hu等(2010)的結果一致，暗示PtrNAC128可能在木質部發育過程中發揮重要作用。系統進化分析發現，PtrNAC128與擬南芥ANAC075、SND2聚在一支，含有典型的NAC結構域。在擬南芥中，Sakamoto等(2015)研究表明，ANAC075可回復nst1-1nst1-3雙突變體的木質部發育缺陷。另外，Fujiwara等(2016)研究發現，ANAC075主要在韌皮部中表達，anac075突變體表現為早花表型。本研究發現，毛果楊PtrNAC128在根、莖、葉中均有表達，其中在老莖中表達豐度最高(圖2), 揭示PtrNAC128可能參與木質部的次生發育。亞細胞定位結果顯示，PtrNAC128定位在細胞核內(圖3)。在楊樹中，NST/SND同源基因均屬于NAC 結構域蛋白，在調控木質纖維、韌皮纖維和木射線細胞的發育過程中發揮重要作用。Zhong等(2015)研究表明，nst1nst3雙突變體不能形成完整的束間纖維，nst1nst2nst3/snd1三突變體完全喪失了形成次生壁的能力。Takata 等(2019)研究表明，vns09vns10vns11vns12四突變體細胞壁組分積累受到抑制導致植株莖不能自然直立，株高較野生型減小。本研究發現，過表達PtrNAC128株高沒有明顯差異。莖段橫切面染色觀察發現過量表達PtrNAC128較野生型植株的木質部細胞層數明顯增加，次生木質部厚度顯著增大(圖4)； 木質素、纖維素含量增加但半纖維素含量沒有明顯變化(表2)，說明過表達PtrNAC128通過影響木質素和纖維素的含量，增加木材的含量。為了進一步分析木質部各組分(木質素、纖維素)含量增加的原因，利用qRT-PCR的方法，檢測了木質素生物合成中11個關鍵酶基因的變化情況。結果表明，轉基因植株中所有木質素合成關鍵酶基因的表達水平顯著增加，其中CAD1、C3H3、C4H2、CCoAOMT1、COMT2、CSE1、HCT1和F5H2變化尤為明顯(圖5)。這些結果表明，木質素含量的增加可能通過調控木質素合成關鍵酶基因的表達水平從而調控木質素的合成來實現的。纖維素也是次生壁重要組分之一。前人的研究表明，楊樹CesA4、CesA7-A、CesA7-B、CesA8-A和CesA8-B是次生壁中纖維素合成的關鍵酶基因(Songetal.， 2010； Xietal., 2016)。本研究結果顯示，過量表達PtrNAC128各株系中纖維素合成酶基因PtoCesA7-A、PtoCesA4顯著上調，纖維素含量增加，半纖維素合成酶基因PtoGT8D、PtoGT43B和PtoGT43D沒有明顯變化，說明PtrNAC128對于木質素和纖維素關鍵合成酶基因具有調控作用，但對半纖維素的生物合成沒有影響。

Zhong等(2011b)研究報道，毛果楊PtrMYB028、PtrMYB090、PtrMYB152、PtrMYB161、PtrMYB168、PtrMYB175、PtrMYB192、PtrNAC105和PtrNAC154/156等基因可被PtrWND2B/6B誘導表達，調控次生壁中木質素、纖維素的累積。本研究結果表明，PtrNAC128可顯著誘導PtoMYB028、PtoMYB152、PtoMYB161、PtoMYB192、PtoNAC105、PtoNAC156的表達(圖6)，暗示PtrNAC128可通過調節這些次生壁組分合成的轉錄因子，進而影響木質素和纖維素的合成。

4 結論

在毛果楊中克隆到一個新的NAC基因PtrNAC128, 該基因轉錄本長度為2 379 bp，ORF長度為1 374 bp，編碼蛋白457個氨基酸，且在 N端具典型NAC結構域; 進化樹構建分析顯示 PtrNAC128與擬南芥NAC075、SND2、SND3聚為一支，組織表達分析顯示在老莖中優勢表達。對PtrNAC128基因的功能分析顯示，毛果楊PtrNAC128通過激活木質素和纖維素生物合成的關鍵酶基因及轉錄因子調控次生壁各組分的生物合成。過表達PtrNAC128轉基因株系的木質素、纖維素的含量均顯著增加，可進一步增加木材的利用率。本研究通過對楊樹PtrNAC128功能的解析，對木本植物定向育種和多功能利用提供了基因儲備。