NF-κB表達在胰腺癌的診斷和預后中的價值*

郭江福，范偉，張瑩

(貴州省人民醫院 急診外科，貴州 貴陽 550002)

研究報道，我國消化道惡性腫瘤發生率逐年上升，胰腺癌發生率也逐年上升[1-2]，其5年生存率僅1%～3%。與其他惡性腫瘤一樣，腫瘤的預后與腫瘤細胞的分期、組織免疫以及生物化學特征有關[3-4]。研究認為，轉錄因子B(nuclearfactor kappa B，NF-κB)在人體固有免疫和適應性免疫反應上發揮重要作用，是引起人體炎癥、腫瘤的關鍵點[5-7]。最新的研究也顯示NF-κB在胰腺炎等胰腺疾病中也發揮重要作用[8-10]。本研究選擇2014年4月—2016年7月收集的胰腺癌樣本及相應癌旁組織各67例、良性胰腺腫瘤樣本45例，采用免疫組織化學方法檢測NF-κB在3組標本中的表達水平，評價其對胰腺癌診斷、浸潤及轉移中的評估價值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料、主要試劑及儀器

1.1.1臨床資料 2014年4月—2016年7月進行手術、2018年7—12月復診隨訪患者(≥24個月)的保存完好的胰腺癌樣本67例、相應病例癌旁樣本67例，另選擇同期良性胰腺囊腫及胰腺炎等手術患者的標本45例。要求所有的組織標本保存完好、患者和(或)家屬知情同意、病理診斷明確和臨床確診，胰腺癌患者為原發胰腺癌、術后隨訪時間≥24個月。胰腺癌組(含癌旁組織)男44例、年齡女23例，41～89歲、平均(61.4±9.6)歲，高分化16例、中分化34例、低分化17例；同期手術的良性胰腺疾病手術標本45例，男30例、女15例，年齡37～88歲、平均(58.4±12.4)歲；2組患者性別、年齡比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.1.2主要試劑與儀器 兔抗人多克隆抗體(上海信裕生物科技有限公司，Abcam)、PBS沖洗液(北京百靈克生物科技有限公司，博士德，AR0194-10)、RM2235石蠟切片機(瑞沃德生命科技有限公司，Leica)、BX51型顯微鏡(日本奧林巴斯有限公司，Olympus)、HGPN-II,HGPF隔水式電熱恒溫培養箱(上海躍進醫療器械有限公司)。

1.2 方法

組織標本采用4%中性甲醛固定、脫水、石蠟包埋，4 μm切片、HE染色。采用高溫高壓法進行抗原修復、DAB顯色，采用NF-KF即用型抗體，嚴格按照說明書進行操作。主要步驟：(1)石蠟切片脫蠟、水化，PBS沖洗3次，每次4～5 min；(2)每張切片滴加3%過氧化氫，阻斷內源性過氧化物酶，室溫下孵育10～15 min，PBS沖洗3次、每次3～5 min；(3)切片加入抗原修復液、微波爐加熱，92～97 ℃持續10～15 min；(4)室溫冷卻20～30 min、PBS沖洗，滴加一抗、室溫孵育60 min，PBS沖洗3次、每次3～5 min；(5)每張切片滴加二抗、室溫下孵育30～60 min，PBS沖洗3次、每次3～5 min；(6)滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察，蒸餾水沖洗，蘇木素染色，梯度酒精脫水，中性樹膠固定。

1.3 觀察指標

觀察胰腺癌癌組織、相應癌旁組織及胰腺良性疾病組織標本中NF-κB陽性細胞表達強度(Uc)、計算NF-κB陽性細胞百分率、制作受試者工作特征(ROC)曲線及計算截斷值，分析NF-κB陽性細胞表達水平對胰腺癌診斷的靈敏度、特異度、陽性預測值及符合率；胰腺癌患者術后隨訪24個月，觀察胰腺癌患者發生淋巴結轉移及遠處轉移與NF-κB陽性細胞表達水平的關系。NF-κB陽性細胞Uc：NF-κB染色定位于癌細胞的胞漿、胞核，呈棕黃色或棕褐色，細胞著色越深，則蛋白表達越強；40×10倍顯微鏡計算5 mm×10 mm網絡微格中的陽性細胞百分率，陽性細胞數<25或不著色為影響(-)、陽性細胞數25%～50%或胞漿染色棕黃色為弱陽性(+)、陽性細胞數50%～70%或胞漿棕黃色為中等陽性(++)、陽性細胞數70%以上或胞漿棕褐色為強陽性(+++)。NF-κB陽性細胞的分級采用積分制度:“-”、“+”、“++”、“+++”分別計作為1、2、3、4分。陽性細胞百分率=所有的陽性細胞積分/(陽性細胞數×4)×100%。

1.4 統計學分析

采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析，NF-κB陽性細胞采用中位數與四分位距M(P25～P75)表示，不同樣本的NF-κB表達分級比較采用秩和檢驗，鑒別診斷效用采用描述性分析，以P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NF-κB陽性細胞表達

胰腺癌組織NF-κB表達強度(++～+++)高于癌旁組織(Uc=2.866，P<0.05)、良性胰腺疾病(Uc=4.330 1，P<0.001)，癌旁組織的Uc值高于良性胰腺疾病(Uc=2.278，P<0.05)。見圖1和表1。

圖1 胰腺癌及相應癌旁組織、胰腺良性疾病組織NF-κB陽性細胞表達Fig.1 NF-κB expression levels in pancreatic cancer tissues, their corresponding adjacent tissues，and pancreatic benign tissues

表1 胰腺癌組織及相應癌旁組織、良性胰腺疾病組織標本中NF-κB陽性細胞[n(%)]Tab.1 Expression intensity of NF-κB in pancreatic cancer tissues, their corresponding adjacent tissues，and pancreatic benign tissues[n(%)]

2.2 NF-κB陽性細胞表達水平對胰腺癌的診斷價值

胰腺癌組織與良性胰腺疾病的NF-κB表達水平截斷值為22%，ROC下曲線面積為0.842。見圖2。置信區間(0.769～0.915，P<0.001)，診斷靈敏度91.0%(61/67)，特異度75.6%(34/45)，陽性預測值84.7%(61/72)，符合率84.8%(95/112)。

圖2 胰腺癌患者NF-κB陽性細胞表達水平的ROC曲線Fig.2 ROC curve analysis of the diagnosis value of NF-κB expression levels in patients with pancreatic cancer

2.3 胰腺癌轉移和復發與NF-κB陽性細胞的表達

胰腺癌患者確診時，已經發生淋巴結轉移24例，NF-κB陽性細胞分級為(NF-κB陽性細胞百分比)44%(38～64)，高于無淋巴結轉移患者[43例，NF-κB陽性細胞分級29%(16～41)]，差異有統計學意義(Z=2.445，P<0.001)；術后隨訪24個月，胰腺癌患者發生腫瘤擴散、轉移、復發40例，NF-κB陽性細胞百分比42%(36～62)，高于無瘤生存的患者[27例，NF-κB陽性細胞百分率30%(17～42)]，差異有統計學意義(Z=2.412，P<0.05)。

3 討論

NF-κB是一種具有多方向性轉錄調節的蛋白子因子，參與了機體炎癥反應、免疫調節及細胞生長與凋亡等重要病理生理過程，NF-κB在肺非小細胞癌、前列腺癌、胰腺癌等惡性腫瘤細胞中呈現高表達[11-12]。有研究表明，NF-κB在胰腺癌組織中高表達，但其在胰腺癌組織種所起作用尚未明確[13-16]。有學者發現，當組織及細胞發生炎癥等改變時會持續激活NF-κB促細胞惡性轉變，而NF-κB信號通路的持續激活會抑制細胞凋亡、刺激細胞的突變，其中NF-κB p65可能在胰腺癌發生中發揮重要作用[17-19]。另一方面，當NF-κB被激活后，可以促進多種炎癥因子、抗凋亡蛋白的轉錄，影響下游IL-6、IL-8、TNF-α、BCL-xL等蛋白的表達，這些蛋白表達異常將會增加細胞的突變率[20-21]，促使胰腺癌發生。本實驗免疫組化結果提示：胰腺癌組織NF-κB表達強度分級以及表達水平高于癌旁組織、良性胰腺疾病，而癌旁組織高于良性胰腺疾病；NF-κB在胰腺良性疾病中亦有表達，認為這可能與胰腺疾病時存在炎癥反應有關，且表達水平也明顯低于胰腺癌。

本實驗ROC結果顯示，胰腺癌組織與良性胰腺疾病的NF-κB表達水平截斷值為22%，以此作為鑒別診斷依據，其中診斷胰腺癌靈敏度91.0%、特異度75.6%、符合率84.8%，高于其他文獻報道的結果[22-23]，這可能與診斷的依據標準差異有關，本次研究中采用積分截斷值進行診斷，而其他文獻單純的采用陽性表達進行鑒別診斷。NF-κB在腫瘤發生相關的細胞因子分析中屬于中間段，其在炎癥、惡性病變中均發揮作用，良性胰腺病變也會出現較高的NF-κB表達[24-25]。因此，單純根據陽性表達鑒別診斷胰腺癌容易導致假陽性。因此，欲提高診斷效用，可聯合NF-κB上下游蛋白的檢測。

本研究中，確診時胰腺癌淋巴結轉移患者的NF-κB表達水平高于無轉移患者，術后隨訪24個月時胰腺癌出現擴散、轉移、復發患者NF-κB表達水平高于無瘤生存患者(P<0.05)，提示NF-κB表達水平可作為淋巴結轉移的輔助判斷依據，還可用于判斷患者的預后，NF-κB高表達的患者出現淋巴結轉移、疾病進展的風險更高。有學者認為NF-κB表達可能與急性胰腺炎癥關系更為密切，即胰腺炎癥病情越嚴重，胰腺中NF-κB表達也越較高[26-27]。因此，檢測組織標本的NF-κB表達水平時，還應考慮患者的病史。