高通量測序分析六味地黃湯對肝腎陰虛型妊娠期便秘患者腸道菌群的影響*

周平，殷文靜，溫濟英，梁海英，邢佳玲，陳丹玲

(廣東省婦幼保健院 婦產科，廣東 廣州 511400)

功能性便秘作為一種常見的胃腸功能失調疾病，由非器質性因素引起排便間隔時間延長、糞便干結及排便困難為主要臨床特征[1]。孕婦由于孕激素分泌增多、增大的子宮壓迫胃腸道及直腸、飲食結構不合理及日常活動量減少等因素，常發生妊娠期功能性便秘，且近年來發病率逐年上升[2-3]。妊娠期便秘若不及時干預可引發宮縮、出現流產或早產，甚至誘發心血管疾病如子癇前期等并發癥。目前臨床上對于妊娠期便秘的處理大都選擇口服乳果糖等瀉劑治療或口服益生菌等微生態治療，但這類方法易產生依賴性及出現腹瀉等胃腸道不良反應[4]。中藥輔助治療妊娠期功能性便秘因其副作用低、依賴性低及復發率低等特點，已被越來越多的患者接受[5]。功能性便秘的病理生理機制復雜尚未完全明確，普遍觀點認為腸道菌群的改變是功能性便秘的主要發病機制[6-7]。隨著分子技術的快速發展，高通量焦磷酸測序技術已被廣泛用于腸道菌群分析[8]。六味地黃湯作為經典的滋腎補陰湯劑，尚無研究將其應用于治療肝腎陰虛型妊娠期便秘。因此，本研究擬通過采用高通量焦磷酸測序分析六味地黃湯對肝腎陰虛型妊娠期便秘患者腸道菌群的影響，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年1—5月門診產檢并診斷為肝腎陰虛型妊娠期便秘患者28例作為研究對象。納入標準：(1)符合中、西醫診斷標準，即西醫診斷參照功能性便秘羅馬Ⅲ診斷標準[9]、中醫診斷參照《中藥新藥臨床指導原則》中的標準，辨證為肝腎陰虛型[10]；(2)近6個月未使用抗生素、益生菌和其他導致便秘的藥物；(3)簽署知情同意書，依從性好。排除標準：(1)有自發性流產、習慣性流產、先兆流產及妊娠劇吐等合并癥史；(2)由其他疾病引起的便秘，如腸梗阻，炎癥性腸病等；(3)有明顯心血管、呼吸、消化、血液、內分泌、神經或精神等疾病；(4)患者實驗期間使用其它影響療效藥物、 出現嚴重不良反應不能堅持參與實驗或失訪者，視為退出病例。28例妊娠期便秘患者年齡20～35歲、平均(28.34±6.13)歲，孕周20～26周、平均(25.46±4.32)周，病程7～14 d、平均(12.65±4.89)d。

1.2 方法

1.2.1治療方法 所有患者均予六味地黃湯藥方(火麻仁30 g，熟地黃、桑椹子、山藥、肉蓯蓉、玄參、麥冬各15 g，山茱萸、茯苓各10 g，砂仁和炙甘草各6 g)治療，加水750 mL/劑，浸泡30 min，煎至250 mL，1次/d，分早晚2次溫水送服，持續2周，并囑患者服藥期間清淡飲食、合理運動、忌寒涼、增加富含粗纖維的蔬菜和水果、適量攝入雜糧及保持規律作息等，若發現任何身體不適，立刻停止用藥。

1.2.2糞便取樣和16S rRNA細菌檢測 六味地黃湯治療前，采用無菌棉簽取所有患者清晨自然排出的新鮮糞便50 g置于大便盒中，并將大便盒和冰塊置于盒子里共同送至實驗室，在實驗室分裝后放入-80 ℃冰箱保存；服藥2周后對患者進行隨訪并再次留取患者的糞便。采用 QIAamp DNA Stool Mini Kit 試劑盒(批號51504，德國QIAGEN)抽提治療前后糞便樣本的總基因組脫氧核糖核酸(deoxyribo nucleic acid，DNA)，通過聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增獲得16S rRNA基因V4標簽片段，構建Illumina平臺文庫，并于Illumina平臺測序。

1.2.3腸道菌群樣本生物信息分析 采用高通量測序技術分析菌群的變化，使用v1.8.0 定量分析微生物生態學(quantitative insights into microbial ecology，QIIME)軟件將操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)代表序列與Greengenes數據庫(v132)比對注釋；根據OTU分析結果，進行Alpha多樣性指數分析；采用Chao1指數計算菌群豐度，采用Shannon和Simpson指數計算菌群多樣性，同時對OTU表格進行稀釋，并繪制稀釋曲線。通過從每個樣本中隨機抽取一定數量的序列，可以預測樣本在一系列給定測序深度下所可能包含的物種總數及其中每個物種的相對豐度[11]。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 稀釋曲線分析

所有患者在治療過程中無明顯不良反應，無退出研究的病例。從稀釋曲線可得知，隨著樣本量的加大，曲線表現為上升趨勢，說明有大量的物種被發現；曲線逐漸趨于平坦，說明測序數據量合理；基本能覆蓋樣本中所有的細菌種類，可以用于后續分析。見圖1。

2.2 腸道菌群豐度和多樣性

治療后妊娠期便秘患者腸道菌群的Chao1指數高于治療前，差異有統計學意義(P<0.05)，但Shannon指數和Simpson指數的差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2。

圖2 治療前后腸道菌群的豐度和多樣性Fig.2 Comparison of abundance and diversity of intestinal flora before and after treatment

2.3 菌群的門、屬分類

治療前后，患者腸道菌群在門水平中均以bacteroidetes、firmicutes和proteobacteria均為高豐度優勢菌群，但治療前后菌群相對豐度比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖3)；在屬水平進行分析，治療前后共有30個菌群豐度發生改變，治療前妊娠期便秘患者腸道菌群相對豐度排前5的菌屬分別為bacteroidetes、faecalibacterium、prevotella_9、subdoligranulum及lachnospira，治療后相對豐度排前5的菌屬分別為bacteroidetes、prevotella_9、faecalibacterium、blautia及lachnoclostridium(圖4)。通過LefSe技術分析尋找有顯著差異性的菌屬，結果顯示經過六味地黃湯治療后，妊娠期便秘患者糞便菌群中共有10個菌屬豐度發生明顯改變，Escherichia、alistipes、parabacteroides、bacteroidesfragilis及coprococcus菌屬豐度較治療前明顯降低，Faecalibacterium、roseburia、bifidobacterium、prevotella及lactobacillus菌屬豐度較治療前升高，差異均有統計學意義(P<0.05，圖5)。

圖3 治療前后腸道菌群在門水平的高豐度物種分布Fig.3 Distribution of high abundance species of intestinal flora at portal level before and after treatment

圖4 治療前后腸道菌群在屬水平的物種相對豐度分布Fig.4 Relative abundance distribution of intestinal flora at genus level before and after treatment

圖5 治療前后腸道菌群LefSe分析Fig.5 LefSe analysis of intestinal flora before and after treatment

3 討論

腸道菌群已成為當今醫學與生命科學研究的熱點領域，它與人體健康息息相關，在參與消化吸收、抵抗致病微生物定植、促進免疫系統發育等方面均發揮著重要作用[12]。眾多研究表明，腸道菌群失調在功能性便秘的發生發展中起重要作用[13-14]。便秘在祖國醫學史上曾記載為“大便難”、“后不利”等[15]。《素問·陰陽應象大論》曰：“陰在內，陽之守也；陽在外，陰之使也”。說明陰與陽之間相互促進、相互制約、相互消長，維持著相對的動態平衡[16]。同理，腸道優勢菌群與致病菌群之間，也存在相互制約又相互依存的關系，共同維持腸道微生態動態平衡[17]。傳統醫學認為，肝主藏血，主疏泄，與膽相表里，腸道菌群比例失調，致病菌數量增加，從而產生內毒素，使肝臟負荷加重，最終導致肝臟功能受損；腎主藏精，主水，主納氣，與膀胱相表里，而腎臟功能受損，體內的廢物不能排出，停留在血管內，隨著血液運行到腸壁血管，進入腸腔，進而影響腸道微生態菌群，打破其平衡狀態[18]。六味地黃湯為肝、脾、腎三陰并補之劑，治以滋補腎陰為主，補瀉結合，開合相濟[19]。

本研究采用Chao1、Shannon和Simpson指數來反映腸道菌群的豐度及多樣性，發現經六味地黃湯治療前后，妊娠期便秘人群的腸道菌群在豐度有明顯差異，多樣性上暫未發現明顯改變，說明六味地黃湯能改善菌群的相對豐度，但腸道菌群的組成結構也具有其穩定性，同一物種的菌群組成是相對恒定的。上述結果與既往對功能性便秘患者腸道菌群的研究不一致。黃林生等[11]探討慢性功能性便秘患者與健康人群之間腸道菌群的差異，發現2組人群的菌群豐富度有顯著差異，而菌群多樣性無明顯差異。余莉等[20]研究發現老年人群與青年人群的菌群物種多樣性相似。各研究結果不同的原因在于：(1)研究對象不同，各研究對象在年齡、生活和飲食習慣等方面存在差異；(2)研究采用的分子生物學技術不統一，或研究采用的干預方式不一致。

本研究分析了妊娠期便秘患者經六味地黃湯治療前后菌群在門水平和屬水平的主成分分布差異，發現在門水平中均以bacteroidetes、firmicutes和proteobacteria為高豐度優勢菌群，且治療前后菌群的相對豐度差異無統計學意義(P>0.05)。在屬水平中，治療前后均以bacteroidetes、prevotella_9 及faecalibacterium菌屬為主，共有30個菌屬發生改變。進一步通過LefSe技術分析發現經過六味地黃湯治療后，妊娠期便秘孕婦糞便菌群中共有10個菌屬豐度發生明顯改變。其中escherichia、alistipes、parabacteroides、bacteroidesfragilis、coprococcus菌屬豐度較治療前明顯降低，faecalibacterium、roseburia、bifidobacterium、prevotella、lactobacillus菌屬豐度較治療前升高，差異均有統計學意義(P<0.05)。眾所周知，lactobacillus和bifidobacterium是公認的益生菌，escherichia則是最常見的致病菌。Nabi等[21]發現服用含lactobacillus的制劑能顯著改善便秘患者的排便狀況。國外一項Meta分析發現與健康人群相比，腸易激綜合征患者的bifidobacterium水平明顯降低[22]。Wang等[23]在洛派丁胺誘導的便秘動物模型中發現，bifidobacteriumadolescentisCCFM669、667可通過黏附在腸上皮細胞，產生丙酸、丁酸等來緩解便秘癥狀，同時治療后乳酸桿菌含量明顯增高，而梭菌屬含量降低。Wang等[24]通過動物實驗研究發現lactobacillusreuterii和lactobacillusaci-dophilus菌群能夠促進腸道的蠕動，而escherichia則抑制腸道蠕動。Escherichia菌屬作為與消化道癥狀最為相關的菌屬，其對“腸-腦”軸的影響也最大。Philip等[25]通過健康人群糞便樣品分析，得出產生γ-氨基丁酸的途徑和escherichia菌屬活躍表達密切相關。以上這些研究結論與本研究結論類似。Leonardo等[26]研究發現，功能性便秘人群的bacteroides、faecalibacterium、alistipes、lachnospira及coprococcus菌屬比健康人群豐度多；黃林生等[11]比較慢性功能性便秘與健康成年人群腸道菌群的差異，發現bacteroides、parabacteroides等菌屬在便秘病人的腸道中豐度增多，而prevotella_2及prevotella_9等菌屬在正常人群的腸道菌群中豐度增高。但Zhu等[27]研究發現prevotella菌屬豐度在便秘人群中下降，firmicutes豐度升高，而bifidobacterium和lactobacillus豐度卻沒有出現降低。這個結論的不一致，考慮可能是因地域、標本采集部位、實驗對象及檢測方法等不同。

綜上所述，妊娠期便秘孕婦經六味地黃湯治療后，其腸道菌群發生一定改變，以益生菌的相對增多和致病菌的相對減少為主。同時從側面說明，六味地黃湯在治療妊娠期便秘上發揮了有效作用。