吉祥草水提物對小鼠慢性阻塞性肺疾病的作用和機制*

陳劍波，張麗娟，邱念念，匡夢嵐，田永昌，張觀學，羅桂林，崔燕，王濤，許鍵煒

(1.沿河土家族自治縣人民醫院，貴州 沿河 565300； 2.貴州醫科大學 細胞工程生物醫藥技術國家地方聯合工程實驗室 & 組織工程與干細胞實驗中心 & 貴州省再生醫學重點實驗室，貴州 貴陽 550004； 3.中國醫學科學院 成體干細胞轉化研究重點實驗室, 貴州 貴陽 550004； 4.貴州醫科大學 護理學院，貴州 貴陽 550004； 5.貴州中醫藥大學第一附屬醫院 呼吸內科，貴州 貴陽 550001； 6.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004； 7.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室，貴州 貴陽 550004)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)是一種以持續存在的氣流受限、慢性支氣管炎和(或)肺氣腫為特征的慢性疾病，全球40歲以上患者的發病率已高達9%～10%，嚴重威脅人群健康，成為位居常見病死亡原因第四位的疾病[1-2]。COPD發病機制至今尚不明確，可能與肺部對香煙煙霧等有害氣體、或有害顆粒的異常刺激導致的慢性炎性反應增強有關[3]。目前針對COPD的治療采取戒煙、脫離粉塵刺激性氣體的環境、避免致敏因素以及吸氧外，藥物治療主要給予支氣管擴張劑、糖皮質激素、祛痰止咳的藥物緩解癥狀[4]。藥物治療對COPD雖有一定的緩解作用，但難以根治。長期使用支氣管擴張劑、糖皮質激素等藥物，不可避免地帶來較多的不良反應，加之COPD患者普遍為中老年，對身體的影響較大。一些中藥、民族藥在治療COPD方面有獨特的優勢。吉祥草，又名紫衣草、小葉萬年青、觀音草等，是百合科吉祥草屬多年生常綠草本植物，主要分布在長江流域以南各省及西南地區[5]。近年來研究發現，吉祥草具有清肺止咳、化痰、抗炎、涼血止血、解毒利咽、固腎以及接骨等功效，是我國西南地區土家族、苗族等少數民族常用的傳統草藥之一[6]。本研究采用煙熏法建立與臨床COPD類似的動物疾病模型，并利用吉祥草水提物治療取得一定療效并探討治療機制，為臨床COPD的治療以及民族藥吉祥草的開發利用提供實驗理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

昆明種小鼠由貴州醫科大學實驗動物中心提供，動物合格號為SYXK(黔)2018-0001；吉祥草飲片由貴州省銅仁市沿河土家族自治縣人民醫院中藥房提供；水浴鍋、蒸餾水、95 %乙醇，黃果樹牌過濾嘴香煙購于煙酒專賣店，灌胃針、FlexiVent肺功能檢測儀，戊巴比妥鈉購自Merck，乙酰甲膽堿(methacholine，Mach)和脂多糖(1ipopolysaccharides，LPS)均購自Sigma，其它試劑為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1吉祥草提取物的制備 方法參照文獻[7]，取吉祥草干燥全草100 g，粉碎，以15倍量蒸餾水煎煮提取3次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮得浸膏，干燥，稱重。得浸膏21.27 g，得率為21.27 %。得率(%)=[提取物重量(g)÷原藥重量(g)]×100 %。

1.2.2實驗分組 取昆明種小鼠，體質量(20±2)g，70只，雌雄各半，適應性飼養2 d后，隨機數字表法將其分為正常對照組(n=20)、模型組(n=30)和吉祥草水提物治療組(n=20)共3組。

1.2.3小鼠COPD模型的建立 參照文獻[8]，并加以改進，通過過濾嘴香煙煙熏法建立COPD模型。將模型組和吉祥草水提物治療組置于體積約為0.5 m3的自制密閉容器內，每次點燃2只過濾嘴香煙，小鼠全身暴露于香煙中，香煙濃度控制在140 mg/m3，香煙熄滅后，繼續保持小鼠處于密閉容器2 h，2次/d，每周5 d，持續8周。第8周建模結束，在模型組中隨機抽取5只雄鼠和5只雌鼠，取肺組織行病理HE染色進行模型鑒定。

1.2.4處理方法 根據《藥理實驗方法學》[9]單位體表面積用藥量折算，小鼠用藥量約為人的9.1倍，成年人用藥量約每天300 mL劑量含30 g原藥，故小鼠用量按原藥量計算約為45 mg/g。根據得率計算，吉祥草水提物治療組小鼠給予吉祥草水提物稀釋液9.45 mg/g定容成1 mL灌胃。造模8周時，予治療組小鼠吉祥草水提物稀釋液灌胃，每天1次，連續治療15 d；模型組和正常對照組予以1 mL純水灌胃，方法同治療組。

1.2.5檢測小鼠肺功能、血清炎癥相關因子表達及肺組織病理學變化 觀察各組小鼠試驗期間的活動、進食及毛發等一般情況。在治療后第15 d，參照文獻[10]，用FlexiVent肺功能檢測儀檢測小鼠肺功能：小鼠按100 mg/kg腹腔注射戊巴比妥鈉，待其達深度麻醉自主呼吸消失后，進行氣管插管，將插管與FlexiVent肺功能檢測儀相連；在含氧21%、呼吸頻率150次/min、潮氣量10 mL、呼吸末正壓力2 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)狀態下進行機械通氣，待呼吸平穩后，霧化給予乙酰甲膽堿(thacholine，Mach)行支氣管激發試驗。Mach濃度依次為0、1.5、3、6、12、25、50和100 g/L，間隔時間為2 min，霧化時間為20 s，誘發小鼠支氣管平滑肌痙攣；同時檢測氣道阻力(airway resistance,Rrs)、氣道彈性阻力(airway elastic resistance,Ers)、動態順應性(dynamic compliance，Crs)、主氣道阻力(main airway resistance,P-3Rn)。麻醉狀態下取血，ELISA法檢測血清中炎癥相關細胞因子白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、環氧合酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)、前列腺素E2(prostaglandin E2,PGE2)以及基質金屬蛋白酶-9(matrix metallopeptidase 9,MMP9)的含量。以上實驗取材完成后，取肺組織行病理HE染色，觀察肺部組織學變化。

1.2.6不良反應觀察 治療前后全程觀察各組小鼠毒副反應的發生情況。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠一般狀況

各組小鼠無死亡，造模組小鼠活動、食量較造模前以及正常對照組減少，毛色晦暗。治療組小鼠在治療后活動、食量增加，毛色光亮，一般狀態好。

2.2 肺功能指標Rrs、Ers、Crs以及P-3Rn的變化

與正常對照組比較，模型組小鼠呼吸系統Rrs增加、Ers增加、Crs降低以及P-3Rn增加，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。與模型組比較，治療組小鼠呼吸系統Rrs降低、Ers降低、Crs升高以及P-3Rn降低，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖1。

注：和模型組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。圖1 各組小鼠肺功能指標Rrs、Ers、Crs以及P-3Rn的變化Fig.1 The effects of herba euphorbiae-derived fluid extract on Rrs, Ers, Cr, and P-3Rn

2.3 血清IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9水平

與正常對照組比較，模型組小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9升高，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型組相比，治療組小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9表達水平下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9比較Tab.1 Comparison of serum IL-1β, IL-6, COX-2, PGE2 , and MMP9 in each group

2.4 組織學觀察

HE染色結果顯示，模型組小鼠肺泡壁破損，形成較大的空腔，支氣管管腔變形，管周小氣道平滑肌增生肥大、管壁增厚，膠原蛋白沉積增加，形成纖維化，細胞的纖毛發生粘連、倒伏、脫失，大量炎性細胞浸潤，肺血管和氣道重塑明顯、管腔狹窄，氣管及支氣管黏液腺增生、腺管擴張，小氣道腔內分泌物多，管周肺泡壁變薄、斷裂、融合，有的形成肺大泡。治療組小鼠氣道結構未見明顯異常，可見少量炎性細胞浸潤，肺泡結構完整、大小正常。見圖2。

模型組 正常對照組 治療組圖2 各組小鼠肺組織觀察(HE，×40)Fig.2 Observation of lung tissues in each group(HE，×40)

2.5 不良反應

實驗全程各組小鼠生命體征平穩，造模后小鼠活動、飲食略減少，其余一般情況無特殊。治療組在給予吉祥草水提物治療后毒副作用不明顯，肝、腎等各大臟器未見明顯損害和腫瘤發生。

3 討論

COPD的確切病因尚不十分清楚，目前認為是環境因素(外因)和個體易患因素(內因)共同作用的結果。外因包括吸煙、粉塵和化學物質的吸入、空氣污染以及呼吸道感染等，內因包括遺傳因素、氣道反應性增高、各種原因導致肺發育不良等[11]。一般認為與慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫發生有關的因素都可能參與COPD的發病[12]。研究表明，炎癥在COPD氣道重塑中發揮著重要作用。炎癥程度隨著疾病的嚴重程度增加而增加[13]。慢性炎癥可引起氣道損傷和修復的頻繁發生，引起氣道結構改變和氣道重塑，導致小氣道狹窄和肺泡壁破壞(肺氣腫)。活化的炎性細胞釋放出多種細胞因子和炎性介質，包括本研究中檢測的IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9等。作為主要促炎因子的 IL-1β在炎癥刺激下由單核細胞、內皮細胞等分泌，是早期炎癥反應中的重要炎癥介質。在趨化炎癥細胞聚集、活化中扮演重要角色，在體內與炎癥細胞因子相互作用，加劇了COPD 的炎癥反應，從而加重肺組織與氣道結構的病理損害[14]。IL-1β、IL-6等可促進COX-2 活化，充斥于炎癥組織，進一步激活巨噬細胞[1]或其他細胞，并使血管舒張、通透性增強，引起支氣管黏膜水腫，增加腺體分泌，導致氣道和氣流阻塞惡化。COX-2 催化花生四烯酸生成PGE2，PGE2能抑制巨噬細胞的生長，擴張血管，增加血管通透性，引起支氣管黏膜水腫，增加腺體分泌，使滲出物堵塞氣道，從而加重氣流阻塞。吸煙可引起的氣道炎癥反應產生氧化應激，激活MMP9，進而激活TGF-β/Smads信號通路，使膠原產生增加、ECM過度沉積，發生肺纖維化，導致氣道重塑[15-16]。本研究結果顯示，上述重要的炎癥因子在煙熏法建立的COPD小鼠模型中均有所增加。結合肺臟病理HE染色發現，炎癥因子的表達與病理損害呈正相關。模型組和臨床COPD病人表現類似[17]。經過吉祥草治療15天后，能有效降低造模小鼠血清中IL-1β、IL-6、COX-2、PGE2和MMP9的水平，減輕其氣道炎癥反應，修復肺臟的病理損害，從而達到治療效果。

COPD 中醫認為屬于“咳嗽”、“肺脹”等范疇，以肺、脾、腎虧虛為發病之本，以痰濁、瘀血為病理產物[18]；吉祥草始載于隋唐時期陳藏器《本草拾遺》，在《本草綱目》、《中藥大辭典》中均有記載[19]，其性平、味苦，具有清肺止咳、涼血止血以及解毒利咽的功效。現代醫學研究發現，吉祥草植株主要含有甾體皂苷類等化學成分，具有止咳、化痰、抗炎的作用[20]，能有效改善人體通換氣功能，抑制炎癥相關因子，促進人體內環境平衡。本研究采用吉祥草水提物對煙熏法建立的COPD模型小鼠進行治療，結果顯示吉祥草水提物安全有效，能抑制炎癥因子的分泌，有效改善COPD模型小鼠癥狀，初步揭示了吉祥草治療COPD的作用機制，為臨床推廣應用提供了理論支持。