鈣結合蛋白S100A4調節小鼠骨髓源肥大細胞活化的作用*

吳通前，金筱茜，馬嵐，周萍萍，李靜，袁銳，余芳***

(1.貴州醫科大學附屬醫院 臨床研究中心，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫科大學 醫學檢驗學院 臨床微生物及免疫學教研室，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫科大學附屬醫院 臨床檢驗中心，貴州 貴陽 550004； 4.湖北醫科大學附屬東風醫院 臨床檢驗中心，湖北 十堰 442008； 5.長沙市第八醫院 臨床檢驗中心，湖南 長沙 410100)

長期以來，肥大細胞因具有分泌多種過敏性介質的能力一直被認為是過敏性疾病的關鍵效應細胞，其激活和募集是過敏性疾病發作和發展的重要效應器[1-4]。肥大細胞的異常積累和激活可促進炎性進展[5]，主要是通過多種途徑激活其表面受體并釋放多種化學介質及炎性因子[5-6]，從而誘導和維持免疫炎癥反應[7-8]。S100A4蛋白屬于鈣結合蛋白S100家族成員，多表達于腫瘤細胞及免疫細胞，存在于細胞核和胞質內，同時也可分泌至胞外發揮功能[9-11]；并可在蛋白磷酸化、細胞生長存活、細胞遷移分化、促進細胞外基質的降解及重塑等方面起到重要的調控作用，如在慢性炎癥疾病中涉及免疫調節與信號通路調節功能[12-15]。已有研究顯示，S100A4蛋白亦參與調節過敏性皮炎、過敏性鼻炎及過敏性哮喘的發生與發展[16-17]，但其對肥大細胞的作用尚不明確。因此，本研究通過體外培養野生型(wild type,WT)及S100A4基因敲除(S100A4-/-)小鼠骨髓源肥大細胞(bone marrow-derived mast cells,BMMC)，探究S100A4與肥大細胞活化的相關性，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1動物 8～10周齡WT和S100A4基因敲除(S100A4-/-)C57BL/6健康雄性小鼠各2只，來自中國科學院生物物理所秦志海教授團隊，均在無特定病原體(specific pathogen free，SPF)實驗室飼養，動物實驗方案獲得本校實驗動物倫理委員會批準(批準號1503057)。

1.1.2主要試劑及儀器 RPMI-1640培養基、胎牛血清、雙抗及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自美國Gibco公司，甲苯胺藍、β-氨基己糖苷酶(β-hexosainidase,β-hex)檢測底物、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、丙酮酸鈉溶液、4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液、2-巰基乙醇及離子霉素(ionomycin，ION)購自美國Sigma公司，蛋白運輸抑制劑布雷非德菌素A、流式檢測抗體白細胞介素-5(interleukin-5，IL-5)、白細胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、白細胞介素-13(interleukin-13，IL-13)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白細胞分化簇117(cluster of differentiation 117，CD117)及Fcε受體I(Fc epsilon receptor I，FcεRI)購自美國BD公司；SYNERGY多功能酶標儀購自美國Therom fisher scientific公司，NAVIOS流式細胞儀購自美國Beckman公司。

1.2 方法

1.2.1BMMC培養 取WT和S100A4-/-C57BL/6健康雄性小鼠各2只，無菌條件下分別取2種小鼠脛骨與股骨提取骨髓，反復吹打至骨髓成細胞懸液，300目過濾網過濾1次，PBS洗2次；用RPMI-1640培養基(含10%胎牛血清、1%雙抗、4 mmol/L L-谷氨酰胺、50 μmol/L 2-巰基乙醇、1 mmol/L丙酮酸鈉溶液、0.1 mmol/L非必需氨基酸、10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液及2 500 μg/L IL-3)重懸細胞，置于37 ℃的5%CO2培養箱中培養WT BMMC以及S100A4-/-BMMC[18]。

1.2.2BMMC鑒定及S100A4表達檢測 取培養第1、2及3周的BMMC，采用甲苯胺藍染色鑒定肥大細胞，分別使用抗小鼠CD117 PE、抗小鼠FcεRI Pacific blue和抗小鼠S100A4 FITC染色，流式細胞術檢測BMMC純度及檢測BMMC的S100A4表達，其中CD117 PE與FcεRI Pacific blue雙陽性細胞(散點圖第四象限)代表成熟BMMC[19]。

1.2.3S100A4蛋白誘導WT BMMC活化檢測 取1.5×109個/L成熟WT BMMC鋪于96孔板，分為S100A4蛋白處理組(S100A4蛋白1 500 μg/L)和PBS對照組(S100A4白蛋等量體積PBS)，各組3個重復，37 ℃的5%CO2培養箱中孵育30 min，4 ℃離心機1 000 r/min離心5 min，分別取各孔培養上清50 μL加至新的96孔板，再分別加入β-hex底物50 μL混勻，37 ℃恒溫搖床孵育1.5 h，酶標儀檢測410 nm處吸光度(optical density,OD)；按上述分組及處理，向各組同時加入蛋白運輸抑制劑布雷非德菌素A 1 μL，37 ℃的5%CO2培養箱中孵育3 h，離心機1 000 r/min 4 ℃離心5 min，去上清，加抗小鼠IL-5 APC、抗小鼠IL6-V450、抗小鼠IL-13 PE及抗小鼠TNF-α FTIC進行染色，流式細胞術上機檢測PBS對照組及S100A4蛋白處理組中成熟BMMC的IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α熒光強度并計算相對熒光指數(relative fluorescence index,rFI)[20]。

1.2.4離子霉素(ION)誘導WT和S100A4-/-BMMC活化檢測 取1.5×109個/L小鼠成熟WT BMMC鋪于96孔板，分為WT PBS對照組與WT ION處理組；同時取1.5×109個/L小鼠成熟S100A4-/-BMMC鋪于96孔板，分為S100A4-/-PBS對照組與S100A4-/-ION處理組。各組3個重復，INO 1 500 μg/L分別加至WT ION處理組與S100A4-/-ION處理組，以ION等量體積PBS加入至WT PBS對照組及S100A4-/-PBS對照組，經ION處理30 min后，各組培養上清用于檢測β-hexOD；經ION處理3 h，流式細胞術上機檢測前述各組小鼠成熟BMMC中IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α熒光強度并計算rFI。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 BMMC培養鑒定及S100A4表達檢測

流式鑒定結果顯示，第1周時小鼠BMMC純度為10%左右，第2周為40%左右，第3周基本成熟，純度達到80%以上(圖1A)；甲苯胺藍染色結果顯示，圖中藍紫色細胞為小鼠成熟BMMC，第1周較少，第2周明顯增多，第3周BMMC基本成熟(圖1B)；S100A4的檢測結果顯示，WT BMMC表達S100A4，S100A4-/-BMMC不表達S100A4(圖1C)。

注：A為成熟WT、S100A4-/-BMMC培養的鑒定結果；B為BMMC甲苯胺藍染色(400×)；C為S100A4在BMMC上的表達。圖1 小鼠成熟BMMC培養鑒定及S100A4表達Fig.1 Identification and S100A4 expression of mature BMMC

2.2 S100A4蛋白誘導小鼠成熟WT BMMC活化檢測

S100A4蛋白處理組小鼠成熟BMMC培養上清β-hex含量高于PBS對照組，差異有統計學意義(P<0.05，圖2A)；S100A4蛋白處理組小鼠成熟BMMC胞內相關炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α表達水平也均高于PBS對照組，差異均有統計學意義(P<0.05，圖2B)。

注：A為β-hex檢測OD值；B為炎性因子rFI水平；(1)與PBS對照組比較，P<0.05。圖2 S100A4蛋白誘導小鼠成熟WT BMMC活化檢測Fig.2 Detection of mature WT BMMC activation induced by S100A4 protein

2.3 ION誘導小鼠成熟WT和S100A4-/-BMMC活化檢測

WT ION處理組小鼠β-hex水平分別高于WT PBS對照組和S100A4-/-ION處理組(P<0.05或P<0.01)，S100A4-/-ION處理組則高于S100A4-/-PBS對照組(P<0.05，圖3A)；WT ION處理組小鼠細胞內炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α表達水平分別高于WT PBS對照組和S100A4-/-ION處理組差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，S100A4-/-ION處理組小鼠IL-5和IL-6高于S100A4-/-PBS對照組差異有統計學意義(P<0.05，圖3B)。

注：A為β-hex檢測的OD值；B為炎性因子rFI直條圖；(1)與WT PBS對組比較，P<0.01；(2)與S100A4-/-PBS組比較，P<0.05；(3)與WT ION組比較，P<0.05。圖3 ION誘導小鼠成熟WT和S100A4-/-BMMC活化檢測Fig.3 Detection of mature WT and S100A4-/-BMMC activation induced by ION

3 討論

S1000A4具有調節血管生成、細胞生存、運動及侵襲等生物學功能，也參與慢性炎癥疾病的免疫調節以及信號通路調節[21]。有研究顯示，在過敏性鼻炎患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培養上清中，通過S100A4抗體處理后IL-5和IL-13降低，證實了其與過敏性疾病的相關性[18]，但作用機制尚不明確，對于過敏性疾病的重要效應細胞肥大細胞的作用研究尚有待開發。因此探討S100A4與肥大細胞作用的相關性在過敏性疾病的發生與發展領域具有潛在的意義。本研究通過WT、S100A4-/-小鼠培養成熟BMMC，BMMC第3周時已基本成熟，純度達到80%以上，為后續實驗提供了實驗基礎，同時成熟BMMC中存在S100A4蛋白的表達。肥大細胞活化是過敏性疾病產生臨床癥狀的重要過程，其活化產生多種炎性介質及炎性因子[22]。通過S100A4蛋白直接作用于成熟WT BMMC后，S100A4蛋白處理組β-hex水平高于PBS對照組(P<0.05)，同時，S100A4蛋白處理組中胞內炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α產生也高于PBS對照組(P<0.05)，提示外源性S100A4蛋白可直接誘導BMMC激活。但其作用機制尚不明確。有研究表明，S100A4在類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)單核細胞中能夠通過Toll樣受體4(toll-like receptors，TLR4)介導炎性應答，促進炎性因子IL-1β、IL-6及TNF-α的釋放，相關腫瘤研究也發現S100A4蛋白通過TLR-4信號通路傳遞功能調節信號[23-24]。因此，有理由推測在肥大細胞的活化中，S100A4可能通過TLR-4這一受體傳遞激活信號，但還需進一步研究來明確。

近期研究表明，通過S100A4抗體封閉過敏性哮喘模型小鼠體內S100A4蛋白的功能發揮后，相對于S100A4未封閉組，小鼠血清及肺泡灌洗液中IL-5、IL-13等炎性因子水平以及氣道炎癥明顯受到抑制，提示通過抑制S100A4蛋白表達可能抑制過敏性疾病的發生與發展，其機制可能是抑制了肥大細胞或嗜酸性粒細胞的活化，進而抑制炎性的產生[17]，但沒有充分的證據證實這一觀點。基與此觀點，本實驗使用ION處理成熟WT及S100A4-/-BMMC誘導其活化，結果顯示β-hex水平明顯低于WT-ION處理組(P<0.05)，S100A4-/-ION處理組胞內相關炎性因子IL-5、IL-6、IL-13及TNF-α水平也低于WT-ION處理組(P<0.05)，這一結果提示S100A4基因的缺失抑制BMMC的活化。這或許是一個證實S100A4在體內參與過敏性疾病調節的潛在研究方向，但還需進一步在體內進行證實。

綜上所述，本研究通過體外細胞學實驗表明S100A4蛋白能夠直接誘導肥大細胞活化及炎性炎性因子的產生，S100A4基因的缺失抑制肥大細胞活化及其炎性因子的產生，為后續其參與過敏性疾病中的作用機制研究提供了前期研究基礎。