重組豬胰蛋白酶原及其突變體在畢赤酵母X33中的組成型表達

竇俊，方宏清，徐登圓，趙珊珊，陳慧梅，徐曉峰，支艷艷，李曉穩，文良柱

1.中國藥科大學，江蘇 南京 211198；2.江蘇萬邦醫藥科技有限公司，江蘇 徐州 221004；3.江蘇萬新醫藥科技（蘇州）有限公司，江蘇 蘇州 215000

巴斯德畢赤酵母（Komagataella phaffii，曾稱Pichia pastoris）是一種常用的甲基營養型酵母，近年來成為備受關注的外源蛋白真核表達系統[1]，成功表達了超出5000個外源蛋白[2]。美國FDA于2006年批準畢赤酵母是安全的微生物（generally recognized as safe，GRAS）[3]，其被廣泛用于表達酶、膜蛋白、抗原、抗體和調節蛋白等多種外源蛋白[4-5]。相比原核表達系統，酵母表達系統具有篩選方法成熟[6]、生長快、外源蛋白表達量高、穩定性好[7]、可翻譯后加工修飾[8]、可基因改造[9]、產物可分泌、可高密度發酵[10]等優點。

啟動子是外源蛋白表達系統中影響外源蛋白高效表達的重要基因表達調控的順式元件。其中，醇氧化酶 1（alcohol oxidase 1，AOX1）基因的啟動子PAOX1是畢赤酵母表達系統最常用的甲醇誘導型表達的強啟動子[11]，廣泛用于酵母的高密度、大規模發酵培養，表達了眾多外源蛋白。

但是，嚴格受甲醇誘導表達的啟動子PAOX1仍有一些不足之處。甲醇易揮發，大規模補料控制工藝復雜[12]，操作過程不便；高濃度的甲醇易燃，可能有火災的安全隱患[13]；甲醇有毒，不宜于飼料工業、食品、醫藥等蛋白生產，容易污染環境。

目前，甘油醛三磷酸脫氫酶（glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase，GAP）啟動子和 pYPT1（GTP酶）啟動子是應用較為廣泛的組成型啟動子。PGAP可利用的碳源有葡萄糖、甘油、甲醇和油酸等，克服了PAOX1啟動子的缺陷，高水平組成表達相當甚至高于PAOX1表達系統的外源蛋白[14]。比起PAOX1的誘導型表達，使用PGAP的組成型表達不需要補加甲醇進行誘導，避免了甲醇帶來的危害，且操作方便，大大縮短了發酵周期，提高了生產效率[15]，更適合大規模連續表達外源蛋白[16]，應用前景廣闊。

黃鵬等[8]利用PGAP在畢赤酵母中表達了高純度和高活性的重組人鵝型溶菌酶2（rhLysG2）；Yang等通過PGAP表達了堿性植酸酶[17]；方煒等[18]構建菌株 GS115（pGAP9K-AMPD），表達了 AMP脫氨酶；王金菊等[19]構建畢赤酵母GS115（pGAP9-16BMP）進行組成型表達，得到了目的產物豬肉風味強化肽。

胰蛋白酶原可被腸激酶或胰蛋白酶自身激活成為活化的胰蛋白酶[20]。胰蛋白酶的相對分子質量為 2.3×104～2.4×104，能專一性水解多肽鏈中賴氨酸和精氨酸C端形成的肽鍵。胰蛋白酶在皮革處理、食品加工、醫藥、臨床診斷、蛋白質組學和重組胰島素的生產等領域應用廣泛[21]。傳統工藝從動物（豬、豬等）胰臟中提取的胰蛋白酶純度低，可能攜帶病原體或病毒，易發生自溶[22]，價格昂貴，在制藥行業中應用受限[23]。在大腸桿菌和畢赤酵母中表達的重組胰蛋白酶原[24]，無外源性病毒污染，無雜酶，酶切反應的特異性較高，無其它副反應[25]，解決了上述問題。徐曉峰等通過構建含胰蛋白酶原基因的質粒，轉化大腸桿菌BL21（DE3），以包涵體形式表達，經過變性復性和激活后得到了胰蛋白酶[26]；汪曉娟等構建了啟動子為PAOX1的質粒，電轉化畢赤酵母GS115，誘導表達獲得了豬胰蛋白酶[20]。

本實驗中，我們采用基因重組技術，利用PGAP組成型啟動子，無需添加甲醇誘導，實現了豬胰蛋白酶原基因在畢赤酵母X33中的重組分泌表達，獲得了活性較高的重組豬胰蛋白酶，簡化了操作，縮短了表達周期，提升了效率，避免了動物源性污染，為后續實驗奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α和畢赤酵母X33均為本實驗室保藏；質粒pGAP-PT、pGAP-PT1、pGAP1-PT1、pGAP2-PT1、pGAP3-PT1、pGAP4-PT1為組成型表達胰蛋白酶原或其突變體的酵母表達載體，委托南京金斯瑞生物科技有限公司構建，由本實驗室保存。

限制性內切酶AvrⅡ（New England BioLabs）；CaCl2、山梨醇、N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽、磷酸、乙腈（國藥集團）；博來霉素（zeocin，Invitrogen）；瓊脂糖（Generay Biotech）；LB抗性培養基含25 μg/mL博來霉素；YPD抗性培養基含 100 μg/mL博來霉素。

組合式搖床（Qiang Le）；高速落地冷凍離心機（Thermo Scientific）；紫外分光光度計UV-2450、基因導入儀SCIENTZ-2C（寧波新芝）；生物超凈工作臺（SUKUN）；立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅）；?KTAexplorer（GE）；隔水式恒溫培養箱（上海一恒）；吸光度酶標儀Apollo 11 LB913（Berthold Technologies Bioanalytic）；LC-MS（安捷倫）；苯甲醚親和層析柱、SP離子交換柱（中科森輝）；HPLC儀（島津）。

1.2 質粒擴增

將質粒采用冷CaCl2法轉化大腸桿菌DH5α，涂布于含25 μg/ml博來霉素的LB固體培養基平板上，37℃倒置培養至菌落形成。篩選陽性克隆點到LB液體培養基中，以37℃、250 r/min的條件培養約16 h，用40%甘油于-20℃保存菌種，并轉接20 μL菌液至200 mL LB液體培養基中，37℃、250 r/min培養約16 h。

1.3 質粒提取、線性化與回收

采用NucleoBond Xtra Midi kit for transfection-grade plasmid DNA-REF 740410.50質粒中抽試劑盒提取上述菌液的質粒，測定質粒含量，并取 20 μg質粒，加入 6 μLAvrⅡ酶，建立總體積為400 μL的線性化酶切體系，37℃孵育2 h。

取少量樣品進行DNA瓊脂糖電泳驗證，結果符合要求后用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0-Cat.9761試劑盒回收，最后一步用ddH2O洗脫。

1.4 畢赤酵母X33感受態制備

具體方法參見文獻[27-28]。

1.5 畢赤酵母X33的電擊轉化和篩選

用基因導入儀將構建的載體與畢赤酵母X33感受態細胞混合，轉入電轉杯，冰浴5 min，將電轉化杯置于電轉儀中，啟動RD鍵開始電擊。轉化結束后立即加入1 mol/L冰冷的山梨醇1 mL，涂布于含100 μg/mL博來霉素的YPD平板進行篩選，30℃培養2～4 d至長出單菌落。

1.6 SDS-PAGE分析

篩選單菌落到3 mL YPD培養基中，30℃、280 r/min培養20～22 h，按起始D600nm為0.05轉接到50 mL YPD培養基中，30℃、250 r/min培養48 h，取1 mL培養液，12 000 r/min離心3 min，取上清加非還原處理液進行SDS-PAGE，觀察結果。

1.7 活性測定

首先采用紫外-可見分光光度法測定濃度。以 0.01 mol/L HCl、0.02 mol/L CaCl2（pH2.0±0.2）緩沖液為空白對照，將樣品用緩沖液溶解或稀釋至約0.5 mg/mL，取光程為1 cm的帶蓋石英比色杯，測定D280nm值。按下式計算蛋白濃度：

式中，df為供試品稀釋倍數，D280nm為供試品溶液在280 nm下扣除空白對照后的吸收值。

然后采用BAEE法，參照中國藥典2015版2部[29]測定酶活力。含有0.25 mmol/L BAEE底物的磷酸鹽緩沖液，光程1 cm，波長253 nm，溫度25.0±0.5℃，測量體積3.2 mL條件下吸光值每分鐘改變0.003相當于1個酶活力單位。

1.8 胰蛋白酶的純化

活化后的菌種按起始D600nm為0.2轉接到含1 L YPD的5 L錐形瓶中，30℃、220 r/min培養48 h，5000 r/min離心15 min收集上清液，設置UV檢測波長280 nm，用SP-FF離子交換介質捕獲胰蛋白酶原，然后加入腸激酶進行激活得到胰蛋白酶，再通過苯甲醚親和層析得到純度較高的胰蛋白酶。

1.9 HPLC分析

1.9.1 色譜條件與系統適用性試驗 用十八烷基硅烷鍵合多孔硅膠填充色譜柱（ODS柱），柱直徑4.6 mm，長25 cm；粒度 3 μm，孔徑200 ?，柱溫40℃。流動相A液為水+0.1%磷酸，B液為乙腈+0.1%磷酸，流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm。洗脫梯度為 0→25→30→34min→35→45 min，對應時間點的流動相B為25%→45%→90%→90%→25%→25%。α胰蛋白酶和β胰蛋白酶的分離度應不小于1。

1.9.2 供試品溶液制備 取適量重組胰蛋白酶，用 0.01 mol/L HCl、0.02 mol/L CaCl2（pH2.0±0.2）溶液配制成70±10 mg/mL，轉移至HPLC進樣瓶。

1.9.3 測定法 取供試品溶液1 μL注入液相色譜儀，Chromeleon 7.2記錄色譜圖。面積歸一化法計算胰蛋白酶純度，積分時間為25 min，扣除空白對照。α胰蛋白酶如有前肩峰采用垂直積分，β胰蛋白酶如有拖尾峰采用切線積分，β胰蛋白酶不低于70%，α胰蛋白酶不高于20%。

1.10 胰蛋白酶LC-MS分析

采用液質聯用儀進行質譜分析。流動相A為超純水+0.1%甲酸，B為ACN+0.1%甲酸。色譜柱為 Sepax Bio-C18，4.6 mm×250 mm，5 μm，300 ?。流速1.0 mL/min，柱溫35℃，檢測波長214 nm。洗脫梯度為0→35→37→38→40 min，對應時間點的流動相B為10%→90%→90%→10%→10%。

2 結果

2.1 豬胰蛋白酶原及其突變體的組成型表達菌株篩選

篩選到的8株X33/pGAP-PT菌株表達上清的SDS-PAGE顯示其中7株在相對分子質量25×103附近有目的蛋白表達，菌株X33/pGAP-PT2和X33/pGAP-PT3表達比較明顯（圖1），考馬斯亮藍法測得X33/pGAP-PT3表達上清濃度為0.088 mg/mL，腸激酶激活后的酶活為39 U/mL。

篩選到的突變體菌株X33/pGAP-PT1表達上清在相對分子質量25×103附近有明顯的目的蛋白（圖2）?？捡R斯亮藍法測得X33/pGAP-PT1-1表達上清濃度為0.115 mg/mL，腸激酶激活后的酶活為130 U/mL，提高了胰蛋白酶原的表達量（圖3）和酶活性。

2.2 不同啟動子對表達的影響

圖1 X33/pGAP-PT表達上清的SDS-PAGE

圖2 X33/pGAP-PT1表達上清的SDS-PAGE

突變體在胰島素原酶切實驗中胰島素得率較高，因此，我們研究了使用 PGAP、PGAP1、PGAP2、PGAP3和PGAP4啟動子的突變體的胰蛋白酶原表達情況。不同啟動子突變體的表達上清SDS-PAGE顯示有目的蛋白表達，且X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP4-PT1表達明顯（圖4）。X33/pGAP1-PT1表達上清蛋白含量最高，考馬斯亮藍法測得濃度為0.123 mg/mL，證明更換的PGAP1啟動子提高了胰蛋白酶原的表達量。

2.3 活性測定

分別將 X33/pGAP-PT、X33/pGAP-PT1、X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP2-PT1、X33/pGAP3-PT1 和X33/pGAP4-PT1甘油菌種活化后按D600nm為0.05轉接到50 mL YPD中，30℃、250 r/min培養48 h，離心取上清，加腸激酶激活，BAEE法測上清酶活性，用UV-2450及配套軟件采集數據（圖5）。X33/pGAP-PT、X33/pGAP-PT1、X33/pGAP1-PT1、X33/pGAP2-PT1、X33/pGAP3-PT1、X33/pGAP4-PT1表達的胰蛋白酶活性依次為39、130、142、72、62、91 U/mL，X33/pGAP1-PT1最高，證明更換的PGAP1啟動子提高了胰蛋白酶活性。

2.4 胰蛋白酶的純化

將X33/pGAP1-PT1進行5 L發酵，離心取上清，對表達上清的胰蛋白酶原進行捕獲、激活和純化，從色譜圖（圖6）可以看到，通過苯甲醚親和層析得到了純度較高的胰蛋白酶，測得濃度為0.94 mg/mL，比活6365 U/mg，活性5983 U/mL。

圖3 X33/pGAP-PT與X33/pGAP-PT1上清SDS-PAGE對比

圖4 X33不同啟動子表達上清的SDS-PAGE

2.5 HPLC分析

對X33/pGAP1-PT1純化后的樣品進行HPLC分析，主峰保留時間15.387 min，首先被洗脫出來的是α胰蛋白酶，且不高于20%，然后是β胰蛋白酶，且不低于70%，分離度不小于1（圖7）。

2.6 胰蛋白酶的LC-MS分析

圖5 BAEE法酶活曲線

對X33/pGAP1-PT1純化后的樣品進行LC-MS分析，質譜測定的相對分子質量為23464.08，根據氨基酸序列推測的相對分子質量為23475.62?？紤]到分子中有6對二硫鍵，相對分子質量減少12，所以理論值為23463.62，測定值與理論值基本一致（圖8）。

圖6 X33/pGAP1-PT1純化圖

圖7 胰蛋白酶的HPLC圖

圖8 X33/pGAP1-PT1的LC-MS圖

3 討論

畢赤酵母表達系統由于自身優勢被廣泛用于表達各種外源蛋白，本研究采用PGAP組成型啟動子，避免了甲醇的使用，安全方便。胰蛋白酶是常用的消化酶，在重組胰島素生產等領域起重要作用。本研究實現了豬胰蛋白酶原在巴斯德畢赤酵母X33中的高效組成型表達，而且產物活性較高，為后續實驗奠定了基礎。

利用畢赤酵母表達系統大規模發酵，經過簡單幾步純化即可獲得高純度的胰蛋白酶，同時有效避免了動物源性污染。在蛋白質組學中，通常需要序列級的胰蛋白酶來特異性切割蛋白質為多肽，因此選擇合適的胰蛋白酶非常重要。胰蛋白酶還可用作藥物，其注射劑能消化溶解變性蛋白，但對正常組織不起作用，臨床應用中能使膿液、瘤液、血凝塊被分解，使引流通暢，創面加速凈化，新生肉芽組織生長，還可分解破壞多種毒蛇毒液中的蛋白質用于解蛇毒。綜上所述，本研究有較好的經濟效益和應用前景。