奧卡西平特異性抑制膠質瘤干細胞的增殖

劉召丹，陳麗樹，滿江紅

國家生物醫學分析中心，北京 100850

腦膠質瘤是人腦最常見的原發性腫瘤，治療方式主要是手術切除腫瘤后輔助放療和化療[1]。Ⅳ級腦膠質瘤為多形性膠質母細胞瘤（glioblastoma multiforme，GBM），惡性程度高，通常對放化療不敏感，患者生存周期僅1年左右[2]。盡管GBM的治療近年取得一些進展，但這類腫瘤發病率和死亡率仍然很高[3]。膠質瘤干細胞（glioma stem cell，GSC）是膠質瘤中一類具有干細胞特性的腫瘤細胞，具有無限增殖能力和多項分化潛能，被認為與腫瘤的起始、轉移和復發密切相關[4]。靶向GSC的治療方法將會有效治療腦腫瘤[5]。

新藥研發是一個耗時且成本昂貴的過程。與新藥研發相比，開發已有藥物的新功能具有很多優勢，不僅縮短了研發周期，而且降低了開發成本[6]。美國食品藥品監督管理局（FDA）批準的藥物庫中的化合物具有較好的生物安全性和明確的靶點信息，應用于開發藥物新用途將加快治療藥物的開發速度[7-8]。

奧卡西平（oxcarbazepine）是美國最近引入的抗癲癇藥物之一，可有效輔助成人和兒童治療，并且可作為成人癲癇的單一療法，與卡馬西平（carbamazepine）相比具有更好的耐受性[9]。此外，研究表明奧卡西平對于三叉神經痛和雙相情感障礙也具有一定的療效[10-11]。本研究表明奧卡西平能夠特異性殺傷GSC，且對人正常神經細胞影響不大，揭示奧卡西平靶向治療腦腫瘤的潛能，從而為開發藥物新功能提供線索。

1 材料和方法

1.1 材料

人正常星形膠質細胞（normal human astrocytes，NHA）購自蘇州北納保藏中心；人GSC（T3691、T3832、T387、T4121、D456）受贈于美國加州大學圣迭戈分校Jeremy Rich實驗室，并且所有細胞在本實驗室都已按照現有方案進行了分離與功能鑒定[12-16]。

B-27血清替代物（B-27 Supplement without vitamin A）、Neurobasal培養基（Thermo Fisher公司；DMEM培養基、胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）、左旋谷氨酰胺、丙酮酸鈉、青霉素-鏈霉素雙抗（邁晨科技有限公司）；澳洲進口胎牛血清（依科賽生物科技有限公司）；表皮生長因子（EGF）、堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）（R&D Systems公司）；細胞消化液accutase（Sigma-Aldrich公司）；CellTiter-Lumi發光法細胞活力檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；奧卡西平（MCE公司）；FDA批準的藥物庫（FDA Approved Drug Library）購于中國科學院生物化學與細胞生物學研究所（中國科學院分子細胞科學卓越創新中心）。

1.2 培養基配制、細胞培養及傳代

1.2.1 培養基配制 向500 mL DMEM高糖基礎培養基中添加50 mL澳洲進口胎牛血清和5 mL青霉素-鏈霉素雙抗，配制為DMEM完全培養基；向500 mL Neurobasal培養基中添加10 mL血清替代物、5 mL丙酮酸鈉、5 mL左旋谷氨酰胺、5 mL青霉素-鏈霉素雙抗、終濃度為10 μg/L的bFGF和EGF，配制為Neurobasal完全培養基。

1.2.2 GSC的培養和傳代 GSC為懸浮生長細胞，采用Neurobasal完全培養基，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。當顯微鏡下觀察腫瘤球較大時，吸取培養皿中的細胞懸液至離心管中，900 r/min離心3 min棄上清，用生理鹽水重懸細胞，900 r/min離心3 min棄上清，清洗細胞表面殘留培養基，用適量accutase重懸細胞，吹打混勻后靜置3 min，加入生理鹽水稀釋終止消化，900 r/min離心3 min棄上清，用Neurobasal完全培養基重懸細胞，轉移至合適的培養皿中繼續培養。

1.2.3 NHA的培養和傳代 NHA為貼壁生長細胞，采用DMEM完全培養基，于37℃、5% CO2恒溫培養箱中培養。當細胞密度為80%左右時需要處理，吸去培養上清，加入生理鹽水清洗表面殘留的培養基，棄上清后向培養皿中加入胰蛋白酶，靜置2～3 min至輕輕晃動后能觀察到細胞脫落，或者在顯微鏡下觀察到細胞懸浮，向培養皿中加入DMEM完全培養基，混勻后反復吹打幾次轉移至新的離心管中，800 r/min離心3 min棄上清，用DMEM完全培養基重懸，轉移至新的培養皿中繼續培養。

1.3 化合物篩選

購買的FDA批準的藥物庫中640種化合物以粉末形式置于8個96孔板中，每種藥物10 mmol，用排槍向各孔藥物粉末中加入10 μL DMSO溶解藥物并混勻；取新的96孔板向對應的孔中加入2 μL藥物，確保槍尖上無殘留液體；處理T4121和NHA細胞后計數，用對應的完全培養基稀釋細胞至每200 μL含有2000個細胞，向96孔板中加入細胞懸液200 μL，使每孔含有2000個細胞，藥物終濃度為10 μmol/L；恒溫培養4 d后高內涵明場拍照，根據細胞成像進行初步篩選。

1.4 細胞活力檢測

將奧卡西平用DMSO溶解后用完全培養基稀釋，使終濃度分別為 2.5、5、10、200 μmol/L，加入DMSO的完全培養基為對照組。向96孔板中加入100 μL完全培養基稀釋的DMSO和不同濃度的奧卡西平，處理不同種類的GSC和NHA，計數處理，用對應的完全培養基稀釋細胞至每100 μL含2000個細胞，向96孔板中加入細胞懸液100 μL，恒溫培養4 d 后加入 100 μL CellTiter，吹打混勻12～15次后吸出200 μL混合液轉移至黑色96孔板，靜置15 min后檢測熒光值。

2 結果

2.1 從FDA批準的藥物庫中篩選到奧卡西平能夠特異性抑制GSC增殖

首先，我們向上述藥物庫中的化合物分別加入T4121 GSC和NHA細胞懸浮液，使藥物終濃度為10 μmol/L，恒溫培養4 d后對細胞進行高內涵明場拍照。根據高內涵細胞成像，按照圖1所示標準對藥物庫進行初步篩選，最終篩選出15種化合物（表1）能夠在10 μmol/L濃度下抑制T4121 GSC增殖且對NHA影響不大。前6種化合物對于T4121 GSC的殺傷作用更明顯，我們從中選擇了治療癲癇的奧卡西平作為進一步研究對象。

圖1 GSC和NHA生長狀態判斷標準

2.2 奧卡西平對多株GSC的特異性抑制作用

用不同濃度的奧卡西平稀釋液分別處理T3691、T3832、T387、T4121、D456 GSC及NHA，培養4 d后檢測細胞活力。隨著藥物濃度的增加，奧克西平對GSC增殖的抑制作用也不斷增加，在濃度為5 μmol/L時已經對多株GSC增殖起到了非常顯著的抑制效果，且對正常星形細胞NHA的抑制作用并不明顯，濃度為10 μmol/L時這一差別更加顯著（圖2）。實驗結果說明奧卡西平能夠比較特異地抑制GSC的增殖，可能為靶向治療腦腫瘤提供依據。

2.3 奧卡西平的藥物作用IC50在NHA中高于GSC

用Graphpad軟件計算奧卡西平小分子化合物在不同細胞中的半抑制濃度（IC50），結果如圖3。奧卡西平在NHA中的IC50（32.68 μmol/L）遠高于GSC（平均值為4.5678 μmol/L），進一步證明了奧卡西平特異性抑制膠質瘤干細胞的潛能。

表1 篩選出的15種能夠特異性抑制GSC增殖的化合物

圖2 不同濃度奧卡西平處理下GSC和NHA的細胞相對活力

圖3 奧卡西平在不同細胞系中的IC50

3 討論

GBM是最常見、惡性程度最高的原發性腦腫瘤，目前針對GBM采取的治療方式主要是手術、放療和化療，但患者的中位生存期仍然小于16個月[17]。替莫唑胺是常用化療藥物，但作用效果短暫，且只對部分人有效，因此迫切需要改進GBM的治療方法[18]。GSC對于傳統的癌癥治療方法包括放療和化療都具有很高的抵抗性，并且是導致腫瘤復發的主要原因[4]。靶向GSC的治療方法仍有待進一步研究[5]。

奧卡西平是一種新型抗癲癇藥物，是卡馬西平的10-酮基衍生物[19]，與后者相比具有更好的耐受性，肝臟毒性更低，更加值得臨床使用[19-20]。我們通過對FDA批準的藥物庫進行篩選，鑒定到奧卡西平能夠特異性抑制GSC的生長，且對人正常神經細胞影響不大。本研究發現了奧卡西平靶向治療腦腫瘤的潛能，有望實現舊藥新用，為腦腫瘤的臨床治療提供潛在的新策略和新方法。