低體溫膿毒癥小鼠模型建立及體溫變化在急性感染中的意義

李艷萍，黃坤，呂宇飛，黃競，于久飛

1.民航總醫院（北京大學民航臨床醫學院）消化腫瘤科，北京 100123；2.軍事醫學研究院 生物工程研究所，北京 100071

膿毒癥是臨床常見癥狀，主要是由感染引起的機體反應失調，最終導致器官功能障礙，常發展為膿毒癥休克，病情兇險，即使經醫療干預，死亡率依然高達35%～40%[1]。任何部位感染均可引發膿毒癥，臨床上常見于腹膜炎、膽管炎、肺炎以及泌尿系統感染等。其中消化系統中多種原因可致病，如消化道急性穿孔或穿孔后保守治療、急性化膿性梗阻性膽管炎、急性胰腺炎，并常常導致膿毒性休克。此外，肝硬化患者由于免疫力低下，很容易發生細菌感染、膿毒癥和膿毒癥所致器官功能衰竭，死亡率可高達65%[2-3]。

膿毒癥致病機理目前被認為是一種復雜的炎癥調節失調，當宿主不能成功地控制感染時，這種炎癥調節失調最終通過影響內皮細胞、上皮細胞和免疫細胞等影響多個器官，從而導致不可逆轉的機體損害[4-7]。膿毒癥炎癥反應可涉及2個不同但并非相互排斥的階段，即全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）和代償性抗炎反應綜合征（compensatory anti-inflammatory response syndrome，CARS），而二者的平衡，以及這些炎癥反應的強度，極大地影響宿主的存活[8-9]。

發熱和體溫過低都是膿毒癥的特征[10]，雖然發熱對機體有一定的損傷，但可幫助機體清除入侵病原體[11-12]。然而，一些嚴重感染的患者在入院時常出現體溫過低（＜36℃）。研究發現體溫過低是死亡率增加的獨立危險因素[12]，因此，臨床上膿毒癥患者體溫過低較發熱更加兇險。一些觀察性研究和隨機對照試驗的數據也表明，10%～20%的膿毒癥患者出現低溫，死亡率約為發熱患者的2倍[12-14]。對于低體溫的原因有多種觀點，一些研究認為是由于體內抑炎因子如IL-10、IL-4等過多表達引起，還有部分研究認為感染可導致中樞體溫調節紊亂。然而，膿毒癥期間體溫過低的機制依然不清楚。為了對低溫膿毒癥進行研究，須建立穩定的動物模型。由于膿毒癥腹部感染率高達72.3%，為最常見的感染部位，同時在國內膿毒癥主要以革蘭陰性菌感染為主[15-16]，因此，我們用常見的腸道致病菌福氏志賀菌，通過腹部感染小鼠，建立了低溫膿毒癥模型，并在感染后進行不同干預，研究感染強度與體溫變化的關系，為膿毒癥導致體溫過低的機制研究提供了思路和方向，也為體溫作為簡單便捷的監測指標提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料

BALB/c小鼠（雌性，16～18 g）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK（京）2016-0006]；福氏志賀菌301株保存于軍事醫學研究院生物工程研究所；福氏志賀菌多糖結合疫苗由軍事醫學研究院生物工程研究所制備；胰蛋白胨和酵母提取物購自Oxoid公司；細胞因子檢測試劑盒和HE染色試劑盒購自索萊寶公司；卡那霉素購自Sigma公司。

1.2 膿毒癥模型的建立

將福氏志賀菌培養用液體LB培養基于37℃、220 r/min培養過夜，之后按照體積比1∶100轉接于新的LB培養基中并培養至菌液D600nm值達到2.0。取100 μL菌液經系列梯度稀釋后涂板計數，計算D600nm值為2.0時每100 μL菌液的菌落形成單位（CFU），之后按照計數濃度，在D600nm至2.0時按照所需劑量以及每只小鼠200 μL的體積，將原菌液稀釋至不同濃度。將50只小鼠隨機分為5組，每組10只，按照不同菌液濃度進行小鼠腹腔注射。

1.3 小鼠體溫測定

以小鼠腸溫作為小鼠體溫。抓取小鼠后腹部朝上，打開小鼠專用體溫計并將檢測探頭前端蘸取少量甘油，將探頭輕輕緩慢插入小鼠肛門約5 cm，靜置5～10 s，待溫度穩定后讀取體溫數值。

1.4 感染后細胞因子檢測

BALB/c小鼠20只，隨機分為正常組和感染組，每組10只，其中感染組按照2×107CFU/只的劑量進行腹腔感染，并于感染后8 h取眼球血，血樣于37℃孵育1 h后4℃過夜，離心收集血清，采用相應的試劑盒檢測血清中各細胞因子濃度。首先將預包被不同細胞因子的板子用洗液洗3次，分別加入100 μL稀釋的不同濃度的標準品和待測樣品，各樣本設置復孔，37℃孵育1 h后洗3次，加入生物素化抗小鼠細胞因子抗體，37℃孵育1 h后洗板3次，加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的鏈霉親和素，37℃孵育30 min后再洗3次，加入顯色液避光反應10 min后加入終止液，酶標儀測定D450nm值，繪制標準曲線，計算各細胞因子濃度。

1.5 小鼠免疫

將30只BALB/c小鼠隨機分為正常組、未免疫組和免疫組，每組10只。免疫組用制備的多糖結合疫苗分別于第0、14、28 d按每只小鼠2.5 μg多糖劑量進行皮下免疫，注射體積為100 μL。末次免疫后14 d按不同劑量對未免疫組和免疫組進行腹腔感染，并測量體溫，觀察小鼠存活情況。

1.6 小鼠感染后治療性干預

將40只BALB/c小鼠按照抗生素使用劑量隨機分為4組（0、5、10、20 mg/kg組）。小鼠以2×107CFU/只的劑量進行腹腔感染，感染后1 h將志賀菌敏感的卡那霉素按照0、5、10、20 mg/kg體重的劑量分別經肌肉注射，測量注射后7 h的小鼠體溫，并連續觀察計算存活率。

1.7 統計學分析

數據采用x±s表示，統計分析利用GraphPad Prism 8軟件完成，計量資料2組之間比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，同時以P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 不同感染后小鼠體溫變化

膿毒癥主要由細菌感染引起，導致全身免疫系統失衡，其中感染劑量與癥狀的嚴重程度具有相關性。為了研究感染劑量與體溫的關系，我們將不同劑量的福氏志賀菌301株經腹腔注射后感染小鼠，評價不同劑量下小鼠體溫變化，定義體溫≤35℃為低體溫。結果發現，在腹腔感染前，小鼠體溫主要為36～37℃，而最高劑量組（2×107CFU/只）在感染后6 h全部為低體溫，低體溫率為100%，其中9只體溫低于30℃，最低達24.2℃，而其余劑量組均正常。隨著時間的推移，其余劑量組小鼠體溫也逐漸降低，其中 1×107、0.5×107和0.25×107CFU/只劑量組的低體溫發生率分別為60%、20%和10%（圖1A）。這一結果表明感染劑量越大越容易出現低體溫。此外，小鼠死亡率隨著感染劑量的提高而提高，同時死亡小鼠幾乎均在每組中體溫最低，提示低體溫與感染程度的相關性（圖1B）。

圖1 不同劑量感染后小鼠體溫及存活情況

2.2 低體溫下機體炎癥反應及臟器損傷

以上結果表明高劑量感染下小鼠體溫顯著降低，死亡率升高，而這種急性條件下高死亡率往往與感染后血管通透性增加、血容量降低導致的低血容量性休克有關。為了證明這一點，我們以2×107CFU/只的劑量進行腹腔感染，在感染后第8 h通過眼球取全血，可以看到與之前結果一致，感染組體溫顯著降低，均低于30℃，最低可低至24.5℃（圖2A）。此外，盡管2組小鼠體重沒有明顯變化（圖2B），但取血過程中未感染組血液流出順暢，平均取血量為722 μL，而感染組血液流出緩慢，平均每只小鼠只獲得131 μL血液（圖2C），證實了這種急性感染可明顯降低血容量。

一般情況下革蘭陰性菌感染機體后，由于內毒素的作用，常伴隨著機體發熱，而本研究所有小鼠在感染后均出現低體溫。為了進一步分析這種感染所引起的炎癥類型，我們檢測了血清中的炎癥因子。結果顯示，感染后8 h機體處于嚴重的細胞因子風暴，IL-1β、IL-6、IFN-γ及TNF-α等促炎因子均具有較高濃度，其中IFN-γ濃度最高，其平均值約18 000 pg/mL，盡管抗炎因子IL-10濃度也有所升高，但相對于促炎因子依然處于劣勢（圖3）。這表明在感染早期，盡管機體體溫降低，但依然以促炎為主。

為了評價這種急性期感染是否會對臟器造成損傷，我們對感染后不同臟器（心、肝、脾、肺、腎）進行了HE染色。可以看到，與正常組織相比，心、肝、脾和肺在急性感染早期均未出現明顯異常，但腎小管上皮細胞明顯水腫（圖4），提示腎臟可能是細菌感染的靶器官。

2.3 感染不同干預后體溫變化分析

以上結果表明嚴重的感染可導致低體溫膿毒癥，而在感染的幾小時內機體即可出現血液灌注嚴重不足，同時處于嚴重的細胞因子風暴，并累及腎臟。那么這種急性感染通過干預而改善后，體溫是否也會隨之恢復？為了驗證這一點，我們采用預防性干預措施，首先對小鼠進行免疫，分別于第0、14、28 d免疫志賀菌多糖結合疫苗，同時以未免疫小鼠作為對照，末次免疫后14 d按2×107CFU/只的劑量進行腹腔感染，感染后8 h檢測小鼠體溫，同時連續觀察7 d，計算各組存活率。結果表明免疫組小鼠低體溫癥狀顯著改善（圖5A），之后連續觀察7 d，免疫組小鼠存活率為100%，未免疫組小鼠全部死亡（圖5B）。進一步，對免疫后小鼠以不同劑量（4×107、3×107、2×107和1×107CFU/只）進行腹腔感染，并測定體溫動態變化，可以看到在不同劑量感染下，免疫后小鼠均100%存活，且隨著感染劑量的降低，體溫下降程度越小（圖5C），提示疫苗在提供保護的基礎上，體溫的降低程度在一定程度上反映出感染的嚴重程度。

之后，我們評價了治療性干預對體溫的影響。小鼠以2×107CFU/只的劑量進行腹腔感染，感染后1 h經肌肉注射，分別給予0、5、10及20 mg/kg體重的卡那霉素，測量抗生素治療7 h后的小鼠體溫。結果表明，隨著抗生素濃度的升高，小鼠存活率隨之提升（圖6A），體溫降低程度也逐漸減小（圖6B），進一步證明感染程度與體溫的相關性。

3 討論

膿毒癥的宿主免疫反應被認為是不同免疫反應的重疊。膿毒癥在早期表現為SIRS，其特征是釋放許多促炎介質，包括早期反應細胞因子，如TNF-α、IL-1、IL-6、IL-12、趨化因子、黏附分子和白三烯等[17]。此外，SIRS可通過釋放抑制性分子，如IL-10、病原體識別信號級聯抑制因子和激素等進行反調節，這種調節也被稱為CARS，從而對過度的炎癥反應起到抑制作用[8,18]。研究發現，在實際病程發展中SIRS和CARS有相當大的重疊，因此患者的整體免疫狀態取決于哪個反應占主導地位[19]。我們的研究結果表明促炎因子IL-6和IFN-γ在血清中的濃度最高，盡管抑炎因子IL-10也有所升高，但遠遠低于促炎因子水平，因此可以判斷感染后小鼠處于SIRS，而此時雖然小鼠體重未發生明顯改變，但血容量顯著降低，提示炎癥導致血管通透性增加，循環血容量降低并累及臟器，成為小鼠死亡的重要原因之一。

圖2 小鼠感染后機體一般情況

圖3 低體溫下小鼠血清中細胞因子濃度

圖4 小鼠感染后腎臟病理變化

圖5 預防性干預后感染小鼠的存活及體溫變化

圖6 治療性干預后小鼠體溫變化

目前，膿毒癥期間體溫過低的病因尚未確定。一些研究發現促炎細胞因子在發熱反應的產生中起重要作用，這些細胞因子或者與位于下丘腦前部視前區附近的特定受體結合[20-21]，或者直接增加環氧合酶的表達，導致前列腺素e2的釋放，通過這些小的脂質介質擴散到血腦屏障，刺激中樞從而引起發熱[20,22-23]。然而多項研究也發現，在臨床上發熱和低體溫病人血液中促炎細胞因子如IL-6、TNF-α等均沒有顯著差別，發熱和低體溫與感染的細菌類型也沒有相關性，目前不能完全證明促炎反應的抑制與膿毒癥中的低溫有關[13-14]。而抗炎細胞因子，如IL-10，在人和動物中具有解熱作用[24-25]，因此，過度的抗炎反應有可能解釋低溫癥[26]。然而，我們的結果也表明，盡管血液中炎癥因子以促炎因子為主導，但小鼠體溫依然顯著下降，甚至低于25℃，進一步佐證了促炎因子與低體溫之間無直接聯系。此外有研究發現低溫患者的精神狀態變化發生率較高[27]，提示低溫可能與下丘腦溫度中樞紊亂以及大腦神經遞質活性改變導致中樞神經系統功能障礙有關。還有研究發現，內皮細胞活化標志物CX3C趨化因子（fractalkine）在低溫下升高，提示血管功能障礙在低溫敗血癥中起作用[28]，這些線索為膿毒癥低體溫的機制研究提供了思路。

在本研究中，我們用不同劑量的細菌感染小鼠，發現小鼠低體溫率和死亡率隨感染劑量增加而增加。此外，我們分別采用預防和治療措施對小鼠膿毒癥進行干預，并檢測體溫變化和存活情況，發現體溫變化與小鼠存活率具有相關性，體溫回升時小鼠存活率也隨之升高。這一結果不僅進一步證明低體溫是死亡的危險因素，同時也表明體溫的動態變化可以作為膿毒癥改善的一個指標，由于體溫檢測簡便易行，有助于臨床快速判斷疾病發展及治療效果，為膿毒癥的及時診治提供時間。