circRNA與子癇前期相關機制的研究進展

陳園園 周紅梅 高藝敏 王利平

子癇前期是臨床常見的一種妊娠綜合征，其臨床表現為高血壓等多系統器官功能紊亂，并可引起胎兒畸形、宮內生長受限等，其發病原因主要為胎盤缺氧及炎性因子釋放等，其發病機制主要為胎盤滋養細胞侵襲引起的胎盤低灌注，還可能為胎盤灌注不良所致的炎性因子等局部微環境介質釋放。環狀RNA(circular RNA，circRNA)在人體、動物及植物中廣泛存在，其結構具有特異性與保守性，隨著信息技術的發展，越來越多的circRNA被發現，子癇前期與正常妊娠孕婦體內存在大量具有差異性表達的circRNAs，表明circRNA在子癇前期形成及發展過程中可能發揮重要調控作用，并可能作為早期預測及評估的重要指標。本研究將circRNA在子癇前期發病機制中的研究進展進行綜述。

1 circRNA 的形成及特征

circRNA與線性RNA不同，其具有閉合環狀結構，主要類型分為外顯子環狀RNA、內含子環狀RNA、外顯子-內含子環狀RNA，其中外顯子環狀RNA是通過前體mRNA的供體外顯子3’端與受體外顯子5’端以共價鍵方式結合形成環狀[1]。circRNA的特征：(1)穩定性：3’端與5’端形成共價閉環結構，其結構穩定性高于線性RNA[2]；(2)普遍性與穩定性：circRNA在人類體內廣泛存在，是較為普通的非編碼RNA分子[3]；(3)特異性：circRNA在組織及發育階段具有差異性表達，并可能成為多種疾病潛在的診斷標志物[4]；(4)保守性：circRNA在不同物種間具有保守性，其在血液、尿液中可被檢測[5]。circRNA本身的生物學特征被認為是血液、尿液等檢查的合適生物標志物，還可能作為多種疾病預測的潛在生物標記物。

2 circRNA 的生物學功能

circRNA含有微小RNA(microRNA，miRNA)的反應元件，其可競爭性結合miRNA而降低其表達，circRNA可充當miRNA的海綿分子而吸附miRNA，還可發揮競爭性內源RNA的作用而調控miRNA的靶基因表達，miRNA與mRNA 3’端非翻譯區結合，circRNA包含miRNA的結合位點，并可通過競爭miRNA而間接調控mRNA的翻譯[6]。circRNA可調節蛋白質的功能，部分miRNA海綿含有特定的RBP結合位點，RBP與mRNA靶點競爭，circRNA可結合部分蛋白質而充當調節蛋白質之間相互作用的支架[7]。circRNA可調節親本基因表達，調節線性剪接[8,9]。少部分circRNA含有開放閱讀框，其可被翻譯成一種新功能蛋白，并可參與腫瘤等疾病發生過程[10]。

3 circRNA 與妊娠疾病的研究進展

circRNA具有一定組織、時序與疾病特異性，其不易被降解而且在體內穩定存在，circRNA可作為臨床診斷標志物并可能是未來疾病診斷及治療的潛在靶點，circRNA相關研究多集中于腫瘤形成與發展過程，早期妊娠中滋養層細胞向子宮蛻膜浸潤是維持妊娠正常的關鍵，而滋養層細胞侵襲與腫瘤細胞生物學行為相似，滋養層細胞遷移及侵襲可能造成不良妊娠結局[11-14]。circPAPPA下調表達通過miR-384/STAT3途徑抑制滋養細胞的增殖和侵襲[15]。circZDHHC20通過miR-144/GRHL2軸抑制滋養細胞中的增殖、遷移和侵襲[16]。circRNA-SETD2/miR-519a/PTEN軸通過調節滋養細胞增殖而影響胎兒出生體重[17]。circ_0085296通過調節miR-144/上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)軸而抑制滋養層細胞的增殖、侵襲和遷移[18]。circ-0005243下調表達通過β-catenin和NF-κB途徑誘導滋養細胞功能異常和炎癥[19]。circ-0000848通過競爭性結合miR-6768-5p促進滋養層細胞遷移和侵襲并抑制細胞凋亡[20]。circ-ZUFSP通過充當miR-203的海綿分子而調節STOX1表達從而調節滋養細胞的遷移和侵襲[21]。circRNA-0054633在妊娠糖尿病中高表達，并且與糖基化指數密切相關[22]。根據GO和KEGG分析顯示，circRNA可能參與糖尿病并發癥中晚期糖基化終末產物受體(AGE-RAGE)的信號通路，可能參與妊娠期糖尿病的發生過程，qRT-PCR證實circ-5824，circ-3636和circ-0395的表達與RNA-seq分析一致，它們的表達水平降低，可為進一步探究與妊娠期糖尿病相關的circRNA提供新方向[23]。circRNA在妊娠期糖尿病患者的胎盤絨毛中異常表達，并在妊娠期糖尿病的發展中發揮潛在作用[24]。研究表明，與健康孕婦的胎盤相比，妊娠期糖尿病患者胎盤中circRNA表達差異，并為探索妊娠期糖尿病的致病機制提供了新的研究見解[25]。顆粒細胞對卵母細胞發育過程發揮重要作用，改變基因表達可影響卵母細胞發育微環境，研究表明卵母細胞circRNA表達異常，其中circRNA-103829、circRNA-103827等在患者中表達上調，其中circRNA-101889表達下調，其表達量與患者高質量胚胎數密切相關[26]。研究顯示ANKRD20A9O位點與漢族人群壽命密切相關，若部分基因異常表達可影響生理與遺傳[27-29]。部分circRNA異常表達與胚胎發育密切相關[30，31]。女性生殖性相關疾病中卵巢上皮性腫瘤占據23%異常，研究表明circRNA在不同腫瘤中表達量具有差異性，部分circRNA在卵巢腫瘤中表達異常，并可作為miRNA的海綿分子從而參與腫瘤發生發展過程[32]。同時女性不孕與circRNA異常表達密切相關，研究表明多囊卵巢綜合征患者中篩選出4個表達差異明顯的circRNA，并發現其可結合miRNA表達[33]。Che等[33]共鑒定出1 032個circRNA在多囊卵巢綜合征卵丘細胞中差異表達，包括311個circRNA增加和721個circRNA減少，進一步的分析表明，異常表達的circRNA具有miRNA結合位點，并且某些microRNA與多囊卵巢綜合征相關，GO和KEGG的生物途徑分析表明異常表達的circRNA及其靶向基因可能與多囊卵巢綜合征相關，為尋找多囊卵巢綜合征患者的關鍵診斷和治療分子生物標志物提供了新線索[34]。研究表明，在多囊卵巢綜合征和對照中分別預測到總共4 258和7 395個候選circRNA，2組之間circRNA的表達方式存在差異，在患有多囊卵巢綜合征的女性中，有四個circRNA被上調，而有23個被下調，GO分析表明，27種差異表達的circRNA主要分布在生物過程途徑中，特別是在涉及炎癥，增殖和與血管內皮生長因子相關的信號傳導途徑中，qRT-PCR證實患有多囊卵巢綜合征的circ-0001577明顯上調，而circ-0020093則下調表達[35]。circPUM1通過充當miR-760的海綿分子而促進多囊卵巢綜合征的進展[36]。circ-0023942可抑制多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細胞的增殖[37]。circ-0118530表達下調通過充過miR-136海綿分子而減輕多囊卵巢綜合征卵巢顆粒細胞損傷[38]。circPSMC3通過充當miR-296-3p的海綿分子而調節PTEN表達從而緩解多囊卵巢綜合征癥狀[39]。Wang等[40]共鑒定到146個上調的circRNA和148個下調的circRNA，ceRNA網絡包括48個miRNA和296個mRNA，功能分析顯示MAPK、PI3K-AKT信號通路與子宮內膜異位癥的發生和發展有關，circRNA在子宮內膜異位癥中差異表達，這可能是該病發病機制的候選因素，并被認為是未來有希望的治療靶點。子宮內膜異位癥是一種常見的婦科疾病，并具有類似腫瘤的生物學行為，circRNA在癌癥的發展中起著重要的作用，但circRNA在子宮內膜異位癥中的功能研究相對較少，研究發現，與對照子宮內膜相比，異位子宮內膜中circ-0067301的表達水平降低，而miR-141-5p的表達水平升高，敲低circ-0067301可促進細胞的增殖和遷移，circ-0067301可充當miR-141-5p的海綿分子從而參與子宮內膜異位癥發生及發展過程[41]。circ-0061140下調表達通過抑制Notch2表達而減弱異位子宮內膜細胞的增殖、遷移和侵襲[42]。雌激素通過circ-0004712/miR-148a-3p海綿功能誘導子宮內膜異位癥的上皮-間質轉化[43]。circRNA在子宮內膜異位癥發生及發展過程中可發揮重要調控作用，并可能作為子宮內膜異位癥診斷及治療的潛在靶點[44,45]。

4 子癇前期發病機制研究進展

血管內皮生長因子(VEGF)、可溶性fms酪氨酸激酶1(sFlt-1)與子癇前期發生密切相關，VEGF屬于一種二聚體糖蛋白，其主要包括：胎盤生長因子(PIGF)、VEGF-A、VEGF-B等，妊娠期間胎盤、子宮內膜等均可產生VEGF，其可調節血管內皮細胞增殖及促進血管生成，研究表明VEGF水平升高可影響胎盤絨毛的灌注從而增加血管通透性進而參與子癇前期的形成[46]。子癇前期妊娠女性胎盤缺氧導致滋養層細胞侵襲從而影響胎盤絨毛血管生成，氧化應激可促進胎盤細胞凋亡，而胎盤細胞凋亡是促進子癇前期形成的重要原因，胎盤血管內皮細胞釋放的炎性因子主要包括：炎性細胞因子、活性氧自由基、凝血素、內皮素1等[47]。妊娠是一種母胎之間的免疫耐受半同種移植反應，母體與胎兒之間的免疫失衡可導致子癇前期等一系列妊娠期疾病，甚至造成早產等[48]。B細胞可通過調控樹突狀細胞分泌細胞因子而影響Th1與Th17分化從而調控Th1/Th2與Th17/Treg，一旦失衡可引起子癇前期等妊娠相關疾病，樹突狀細胞可作為抗原呈遞細胞，其在妊娠中可發揮重要作用[49]。miRNA是一類長度約22 nt的內源性非編碼單鏈小RNA分子，其可通過一系列酶的修飾剪切后以堿基互補配對的形式與mRNA的3’端非轉錄區結合形成穩定性結構，進而抑制靶基因表達，miRNA在多種疾病發生及發展過程中均發揮重要調控作用，微小RNA-371-3(microRNA-371-3，miR-371-3)位于19號染色體，其在滋養層細胞中呈高表達，隨著妊娠時間的延長而明顯升高[50]。既往研究表明，子癇前期妊娠女性胎盤中miRNA表達異常并可能以外體形成運輸至循環體液進而參與疾病發生發展，miRNA可作為預測子癇前期、心血管疾病等多種疾病的潛在生物標記物[51]。微小RNA-210(microRNA-210，miR-210)與微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)在子癇前期發生發展過程中可發揮重要調控作用，miR-210可靶向同源型A9(HOXA9)與酪氨酸蛋白激酶A3(EFNA3)而抑制滋養層細胞遷移及侵襲，并可重塑血管，促進子癇前期發生[52]。微小RNA-139-5p(microRNA-139-5p，miR-139-5p)可靶向調控sFlt-1而促進子癇前期妊娠婦女滋養層細胞增殖及侵襲[53]。微小RNA-30b(microRNA-30b，miR-30b)可調控基質重建相關蛋白5(MXRA5)/絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑從而誘導胎盤滋養層細胞凋亡[54,55]。綜上所述，miRNA在子癇前期形成過程中可發揮重要調控作用，并可影響滋養層細胞增殖、遷移及侵襲，并可能作為診斷子癇前期的潛在生物學標記物。

5 circRNA 與子癇前期早期診斷中的研究進展

circRNA屬于一種新型內源性轉錄物，其可參與細胞分化、增殖及凋亡等多種生物學過程，其具有穩定性、普遍性、穩定性及保守性等特征，并可能作為子癇前期潛在生物學標記物。研究表明，對子癇前期患者與健康孕婦血液中的circRNA表達進行鑒定，結果顯示子癇前期患者血液中circ-101222的表達水平明顯升高，circRNA可通過充當miRNA的海綿分子而發揮作用，通過生物信息學分析顯示circ-101222與miR-181存在結合位點，并可調控miR-181的表達，而miR-181在子癇前期發生過程中可發揮重要調控作用[56,57]。推測circ-101222可能通過負向調控miR-181的表達從而參與子癇前期發生過程。進一步研究發現circ-0001855與circ-0004904在子癇前期患者中的表達水平升高，PAPP-A的表達水平明顯升高，生物信息學分析顯示circ-0001855與circ-0004904均可競爭性結合miR-138-5p、miR-623、miR-134-3p、miR-29a-5p，而上述miRNA均可靶向結合PAPP-A，并可負向調控PAPP-A的表達及活性，已有報道指出miR-29a-5p在子癇前期發病過程中發揮重要調控作用[58]。推測circ-0001855與circ-0004904均可能充當miRNA的海綿分子而減弱其對靶基因PAPP-A的抑制作用進而參與子癇前期發生過程，還可能作為子癇前期診斷的潛在分子標記物。采集的胎盤組織樣本、GEO數據庫與正常組織相比，子癇前期中jak-stat信號通路被激活，miR-100-5p表達下調，LIF表達上調，hsa-circ-0088196與miR-100-5p表達呈負相關，并可能結合miR-100-5p[59]。表明hsa-circ-0088196在子癇前期中呈高表達，并可能作為診斷子癇前期的潛在生物學標記物，其作用機制可能與負向調控miR-100-5p有關。鑒定重度子癇前期和正常孕婦女性胎盤中的circRNA表達譜，共檢測到18 631個circRNA，其中，有180個circRNA差異表達，包括94個上調circRNA和86個下調circRNA，選取其中幾個circRNA進行分析，包括hsa-circ-0007611、hsa-circ-0011460、hsa-circ-0002888、hsa-circ-0007445、hsa-circ-0017068、hsa-circ-0012737，進一步分析發現hsa-circ-0011460與溶質載體有機陰離子轉運蛋白家族成員2A1(SLCO2A1，PGT)在重度子癇前期胎盤中的表達水平均明顯升高，RIP實驗證實hsa-circ-0011460直接靶向PGT[60]。表明hsa-circ-0011460與其宿主基因PGT直接相互作用，hsa-circ-0011460可能作為重度子癇前期診斷及治療的潛在靶標。重度子癇前期中hsa-circ-0001438、hsa-circ-0001326和hsa-circ-32340的表達上調，其可調節miRNA及mRNA的表達[61]。表明circRNA表達譜的變化可能與重度子癇前期的發病機制有關，并可能充當生物標志物。子癇前期的病因和發病機制尚不清楚，并且尚無理想的早期臨床生物標志物來預測子癇前期，使用微陣列分析人類正常和子癇前期胎盤中差異表達的circRNA，結果顯示hsa-circ-0036877，hsa-circ-0036878，hsa-circ-0055724，hsa-circ-0049730、hsa-circ-0036474在子癇前期中異常表達，其中hsa-circ-0036877可作為競爭性內源性RNA而參與子癇前期發生過程，并可能作為子癇前期早期潛在的新型生物標記[62]。同時相關研究發現circRNA在子癇前期中異常表達，并可能參與子癇前期發生及發展過程，還可能作為早期診斷子癇前期的潛在生物學標記物[63-65]。

6 circRNA 在子癇前期發病機制中的研究進展

滋養層細胞向子宮內膜和脈管系統的遷移和侵襲是人類胎盤發育的關鍵步驟，子癇前期是一種破壞性的多系統綜合征，其特征是滋養層細胞浸潤和狹窄螺旋動脈未轉化。采用定量實時熒光定量PCR技術檢測70例子癇前期女性和43例健康妊娠對照者胎盤組織中circHIPK3的表達，通過敲低siRNA和過表達質粒轉染了滋養層細胞系(HTR-8/SVneo)中circHIPK3對滋養層細胞遷移、侵襲、增殖、管形成及凋亡的影響，結果顯示與健康懷孕對照組相比，子癇前期中circHIPK3的表達水平明顯降低，沉默circHIPK3可明顯抑制HTR8/SVneo細胞的遷移、侵襲、增殖及管形成能力，而circHIPK3過表達可明顯促進HTR8/SVneo細胞的遷移、侵襲及管形成能力[66]。表明circHIPK3的異常表達可能通過調節滋養層細胞增殖、遷移及侵襲等生物學行為而導致子癇前期的發展。上皮-間質轉化(EMT)調控的細胞遷移和侵襲功能異常可參與子癇前期的發病過程，與正常妊娠胎盤相比，circTNRC18在子癇前期胎盤中上調表達，circTNRC18可負調控滋養層細胞遷移和EMT，circTNRC18可充當miR-762的海綿分子而抑制其表達，并可提高EMT相關轉錄因子Grhl2的表達水平，子癇前期胎盤中miR-762的表達水平降低，并可促進滋養層細胞遷移及EMT，Grhl2在子癇前期胎盤中高度表達，circ-TNRC18可靶向結合miR-762而減弱其對Grhl2的抑制作用從而促進滋養層細胞遷移及EMT[67]。表明circTNRC18/miR-762/Grhl2分子軸在滋養層細胞遷移和EMT中起關鍵作用，circTNRC18/miR-762/Grhl2分子軸可能是子癇前期潛在的治療靶標。circ-0063517與B型內皮素受體(ETBR)在子癇前期中下調表達，而miR-31-5p的表達水平明顯升高， circ-0063517過表達或抑制miR-31-5p表達可促進血管內皮細胞的生長、遷移及血管生成，敲低circ-0063517可抑制ETBR、VEGFA、VEGFR2的表達，circ-0063517可充當miR-31-5p的海綿分子而調節ETBR的表達，circ-0063517可通過促進ETBR表達而促進血管生成[68]。表明circ-0063517/miR-31-5p/ETBR分子軸可調節血管生成從而參與子癇前期發生過程。circRNA鋅指DHHC型棕櫚酰轉移酶20(circZDHHC20)在子癇前期胎盤中表達水平升高，而miR-144的表達水平降低，circZDHHC20可充當miR-144的海綿分子而發揮作用，circZDHHC20過表達可抑制滋養層細胞的增殖，遷移和侵襲，而敲低其表達可發揮相反的作用，miR-144可介導circZDHHC20對滋養層細胞行為的調節過程，miR-144可靶向結合類顆粒狀2(grainyhead-like 2，GRHL2)并可負向調控其表達，circZDHHC20通過充當miR-144的海綿分子而調節GRHL2表達[69]。表明circZDHHC20高表達可通過充當miR-144的海綿分子而上調GRHL2的表達從而抑制滋養層細胞增殖、遷移及侵襲，為進一步揭示子癇前期發病機制提供了新的方向。hsa-circ-0111277/miR-494-3p/HTRA1/Notch-1分子軸促進并調節滋養層細胞的遷移和侵襲，為探索子癇前期的新治療方法提供了新方向[70]。circPAPPA在子癇前期胎盤和血漿樣品中表達水平降低，敲除circPAPPA可抑制HTR8-S/Vneo滋養層細胞的增殖及侵襲，miR-384與circPAPPA存在結合位點，circPAPPA可靶向結合miR-384并可負向調控其表達，進一步研究發現miR-384可靶向結合編碼信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)，miR-384過表達可抑制細胞增殖和侵襲，circPAPPA可充當miR-384的海綿分子而調控STAT3的表達[71]。表明敲除circPAPPA可通過調控miR-384/STAT3分子軸而抑制滋養層細胞增殖及侵襲，可為進一步揭示子癇前期發病機制奠定實驗基礎，還可為子癇前期治療提供潛在分子靶點。miR-17可參與胎盤組織血管生成過程，并可靶向ephrin-B2/Eph-B4受體(EPHB4)而參與子癇前期發生過程，進一步研究顯示多種circRNA均包含有miR-17的結合位點[72]。由此推測circRNA可通過靶向結合miR-17而參與子癇前期發生及發展過程。子癇前期胎盤組織中存在300多個差異性表達的circRNA，其中circ-0014736、circ-0015382在子癇前期胎盤組織中表達水平升高，而circ-0007121的表達水平明顯降低，其可通過調控蛋白結合、缺氧反應等從而參與子癇前期發生及發展過程，并可能成為子癇前期診斷及治療的潛在靶點[73]。綜上所述，circRNA在子癇前期中異常表達，并可通過充當miRNA的海綿分子而調節其靶基因表達進而參與子癇前期發生及發展過程，還可能作為子癇前期治療的潛在靶點。

子癇前期已嚴重威脅母嬰健康，目前關于子癇前期發病機制尚未完全闡明，隨著生物技術的發展，circRNA在子癇前期中的功能作用已受到重視，circRNA可充當miRNA的海綿分子而調控細胞增殖、分化等多種生物學過程進而參與多種疾病發生發展過程。但circRNA在子癇前期發病機制中的研究相對較少，而子癇前期患者胎盤組織及血漿中circRNA可通過與miRNA結合而減弱其對靶mRNA的抑制作用從而調節mRNA的表達，circRNA/miRNA/mRNA分子軸可能是參與子癇前期發病機制的重要途徑。但circRNA是否可通過與RNA相關蛋白結合等方式參與子癇前期發生及發展過程尚需進一步探究。circRNA本身具有組織特異性與穩定性，其可能作為子癇前期診斷及治療的潛在分子標記物。隨著深入研究circRNA在子癇前期發病機制中的作用，有可能出現針對circRNA為靶點的治療方法。