孟根烏蘇-18味丸對銀屑病樣小鼠模型治療的機制研究 *

白 爽, 圖門烏力吉, 楊東生, 衛 瑋, 呂新翔

(1.內蒙古醫科大學附屬醫院皮膚科,內蒙古呼和浩特010050; 2.內蒙古醫科大學附屬醫院蒙醫科)

1 材料與方法

1.1實驗動物

選取6～8wk雌性balb/c小鼠(購買于內蒙古醫科大學動物中心)。飼養于恒溫恒濕的SPF級別動物實驗室,自由給水、取食。

1.2主要試驗材料與儀器

孟根烏蘇-18味丸購買于內蒙古呼和浩特市蒙醫中醫醫院(生產批號:20160003),咪喹莫特乳膏(四川明欣利迪藥業),HE染色液(上海碧云d生物技術有限公司)。切片機(上海徠卡儀器有限公司)、包埋機(湖北泰維科技實業有限公司)。酶標儀(BioTek,ELx800)、Mouse IL-17Precoated ELISA kit(DAKEWE Cat3∶1211702),生物顯微鏡(OLYMPUS CX41),組織勻漿機(上海凈信實業發展有限公司,MY-20)。

1.3實驗方案及分組

實驗分為2組,分別為對照組及治療組,每組15只小鼠。所有小鼠均于實驗前1d麻醉后背部剃毛。將咪喹莫特乳膏外涂所有小鼠的背部(62.5mg/鼠),藥時間為持續21d。第8～21d治療組小鼠給予孟根烏蘇-18味丸灌胃(0.66g/kg),實驗組小鼠給以等量生理鹽水灌胃。每d觀察各組小鼠的背部皮損狀況(包括紅斑、鱗屑、皮膚厚度)。

1.4實驗方法

1.4.1組織學檢查 常規固定、脫水、包埋、切片、蘇木精-伊紅染色。

11月6日，證監會正式發布《關于完善上市公司股票停復牌制度的指導意見》（下稱《指導意見》）?！吨笇б庖姟肥状蚊鞔_了上市公司股票停復牌的基本原則，最大限度保障交易機會。明確以不停牌為原則、停牌為例外，短期停牌為原則、長期停牌為例外，間斷性停牌為原則、連續性停牌為例外。上市公司發生重大事項，應當按照及時披露的原則，分階段披露有關事項的具體情況，不得以相關事項不確定為由隨意申請股票停牌，不得以申請股票停牌代替相關各方的保密義務。

1.4.2表皮厚度及真皮內炎細胞浸潤數的測量 采用PhotoshopCS4軟件自帶的套索工具進行表皮厚度的測量及真皮內炎細胞浸潤數的測量

1.4.3小鼠脾指數及淋巴結橫截面積計算 小鼠脾指數為小鼠脾臟重量與小鼠全身體重的比值。每只小鼠取4枚淋巴結,近似認為小鼠淋巴結為橢圓形,按照橢圓形面積公式計算小鼠淋巴結橫截面積。

1.4.4皮膚組織勻漿的制備 將分裝的皮膚組織置于d平上稱重并記錄。1×PBS快速漂洗后將皮膚組織置于1.5mL的EP管中,加入預冷的1×PBS。統一制成5%的組織勻漿。使用組織勻漿機在冰上研磨小鼠皮膚,離心(12000g,10min,4℃),吸取上清置于新的EP管中,并置于冰上用于ELISA檢測。

1.4.5小鼠麻醉后采血,室溫靜置20min。采用離心法獲取血清,(5000rcf,15min,24℃)分裝血清并及時儲存于-80℃冰箱。

1.4.6酶聯免疫吸附實驗(ELISA) 按試劑盒操作說明進行加樣,加檢測抗體,洗板,加酶,洗板,顯色,終止反應,讀板。用檢測波長450nm讀值。

2 結果

2.1組織學改變

兩組小鼠組織學均表現為角化過度、角化不全,表皮增厚,表皮突延長,真皮內炎細胞的浸潤。與對照組相比,治療組小鼠表皮厚度明顯降低(*P<0.05),炎細胞浸潤數明顯減少(**P<0.01)(如圖1、2)。

2.2與對照組相比,治療組小鼠脾臟明顯縮小,脾指數及淋巴結橫截面積明顯下降(*P<0.05)(如圖3、4)。

2.3皮損中IL-17的含量

與對照組相比,治療組小鼠皮損中IL-17含量明顯降低(*P<0.05)(如圖5)。

2.4血清中IL-17的含量

我們沒有檢測到兩組小鼠血清中IL-17的含量。

3 討論

銀屑病屬于蒙醫皮膚黃水(協日烏素)病,蒙醫對于銀屑病的治療主要以調理三根,改善氣血運行,燥協日烏素(黃水)為主要原則[2]。孟根烏蘇-18味丸是經典的蒙藥學方劑,由孟根烏蘇(制)八錢、硫磺(制)四錢、文冠木膏劑等十八味藥配制而成,該藥載入1984年版《內蒙古蒙成藥標準》[3]。孟根烏蘇-18味丸主要具有燥黃水,消炎止痛,促進創口愈合,修復組織等功效。在皮膚病的治療占到其臨床應用的76.23%,主要包括:銀屑病、痤瘡等炎癥性皮膚病[3,4]。本研究將蒙醫藥學與免疫學、皮膚病學相結合,探索性研究蒙藥孟根烏蘇-18味丸對銀屑病的治療效果及機制。

小鼠背部外涂咪喹莫特可以成功的誘導出與人類銀屑病模型,這種模型在病理學、發病機制中均表現出與人類銀屑病相一致的特點[5]。我們利用此模型為實驗對象,結果顯示,與對照組相比,治療組小鼠表皮厚度及真皮內炎細胞浸潤數均減少,這從組織病理學角度表明孟根烏蘇-18味丸能夠減輕銀屑病樣小鼠模型的癥狀,干預銀屑病發病。

脾臟是免疫細胞定居的主要場所之一,同時也是機體進行免疫應答的重要部位[6],脾指數可以衡量藥物對免疫器官的抑制作用[7]。我們的研究中,治療組的脾指數、淋巴結大小與對照組相比明顯下降,可見孟根烏蘇-18味丸能夠干預銀屑病樣小鼠模型的免疫應答,降低脾臟及淋巴結內異常增殖的免疫細胞的數量,進而抑制銀屑病樣小鼠模型的炎癥通路及免疫反應。

Th17是一類新型的Th細胞群,分泌白細胞介素17(interleukin6,IL-17)等多種細胞因子。新近理論認為,Th17在銀屑病發病過程中起著主導作用[9]。Th17相關炎癥信號通路在銀屑病的發病過程中起著重要的致病作用。在我們的實驗中,治療組小鼠皮損中IL-17的含量明顯低于對照組,這表明孟根烏蘇-18味丸通過下調皮損中IL-17的表達而起到對銀屑病的治療,進而我們認為孟根烏蘇-18味丸通過干預Th17信號通路達到對銀屑病的治療作用。我們沒有檢測到兩組小鼠血清中IL-17的含量,這可能是由于小鼠血清中IL-17含量少,低于檢測下限而造成的。

綜上,蒙藥孟根烏蘇-18味丸通過降低銀屑病樣小鼠模型表皮厚度、真皮內炎細胞浸潤數及降低脾指數、淋巴結橫截面面積及干預Th17相關炎癥因子的表達對銀屑病發揮治療作用。