混合型癡呆的動物模型研究進展

汪賢竹 張 菁

浙江大學醫學院附屬邵逸夫醫院藥學部，浙江杭州 310016

混合性癡呆（mixed dementia，MxD）是指患者同時患有阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）和腦血管病（cerebrovascular disease，CVD），臨床上既表現有神經退行性變，也存在腦血管性病理改變的疾病[1]。以上這兩種病變既可單獨導致癡呆的發生，也可以相互作用，影響癡呆的進程[2]。然而上述兩種病變發揮協同作用的機制仍不清楚，因此，急需建立一種能有效模擬人類MxD發病及病理特點的動物模型。近年來關于MxD動物模型的研究日漸增多，并取得了一定進展，本文對MxD動物模型進行綜述。

相較于血管性癡呆（vascular dementia，VaD），根據其病理特點，AD已發展出很多成熟的動物模型。神經細胞β-淀粉樣前體細胞[myloid beta （A4） precursor protein，APP]由于變異，可在錯誤的位置經酶切后會形成淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ），成為AD的特征性病理改變[3]。利用基因工程的方法將人源性APP（野生或突變）基因導入小鼠中，使其過表達，就會引起Aβ沉積異常、tau蛋白異常磷酸化、腦淀粉樣血管病、腦萎縮、神經元凋亡、認知缺陷和行為障礙等神經退行性改變癥狀[4]。目前APP轉基因小鼠模型，如PDAPP、Tg2576、APP23、CRND8，均已廣泛應用于AD的實驗研究。而腦血管病變的模式動物可按模擬腦血管病的成因分為缺血型、高血壓型、糖尿病型等類型。兩種疾病模型的有機結合就形成了MxD的動物模型。

1 缺血-AD模型

1.1 慢性低灌注-AD模型

APP23小鼠是過表達人APP751突變基因（Swedish 2個點突變K670N、N671L）AD的模式動物[5]。對APP23小鼠行雙側頸總動脈結扎術，以逐步降低腦血流量來模擬腦血管病變的作用[6]。結果顯示，與包括野生型假手術組小鼠以及APP23假手術組在內的對照組相比，低灌注-APP23組小鼠tau蛋白磷酸化和α-突觸核蛋白磷酸化顯著增高。表明缺血損傷促進了AD小鼠神經退行性病理特征。另外，低灌注-APP23組小鼠血管壁上MMP-9顯著激活，表明該模型存在嚴重的血腦屏障損傷，神經血管重塑加劇。腦源性神經營養因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）是 Neurotrophin家族的成員，在神經元生長和存活中起重要的作用，被認為和認知能力有關[7]。低灌注-APP23組小鼠血管內皮細胞中BDNF表達量顯著降低。

綜上，該模型操作簡單，既模擬了MxD中血管病變的因素，也涉及了AD相關的病理改變，但該研究只關注了神經病理學上的變化，包括從BDNF上的間接體現，但缺點是未檢測能直接體現認知功能變化的指標，如認知行為學的改變。

1.2 MCAO-AD模型

該模型的腦血管病變是通過在小鼠中進行遠端大腦中動脈栓塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）加缺氧構建。吸入異氟烷麻醉的小鼠，在顳肌處切開切口，在肌肉中創建了一個口袋以露出下面的頭骨，并確定大腦中動脈的位置。使用微鉆頭來暴露下面的大腦中動脈。切開腦膜，并使用小血管燒灼器對血管進行燒灼。最后，使用手術膠封閉傷口。手術后立即將小鼠置于含有9%氧氣和91%氮氣的空間內45 min。除大腦中動脈燒灼外，假手術小鼠進行了相同的手術步驟，并且在手術后45 min內也接受了9%的氧氣和91%的氮氣處理。在整個手術和缺氧期間，所有小鼠體溫均維持在37℃[8]。在缺氧的輔助作用下，能形成包括約25%的手術同側腦半球面積的梗死。而另外一部分的AD模型采用的是hAPP-SL的轉基因小鼠模型。除了認知行為障礙，老年性癡呆患者還大多伴隨精神行為異常，包括焦慮、抑郁、冷漠、妄想和幻覺[9]。因此，此模型研究者還采用了水平爬梯，Y迷宮和新事物識別實驗，光(暗)轉變測試來分別測試小鼠的運動，認知以及焦慮狀態。在術后4周，研究者發現，缺血都會加劇年長hAPP-SL小鼠的以上各種行為缺陷。且與假手術的hAPP-SL小鼠相比，缺血的hAPP-SL小鼠的丘腦白質區和內囊中的磷酸化的tau蛋白也顯著增多。但是，與對側半球相比，同側腦區的磷酸化的tau蛋白的面積無差異，表明MCAO損傷以全腦損傷的模式加劇了缺血對hAPP-SL小鼠中與AD相關的病理學。另外，研究人員在手術后12周對同側腦區勻漿中的Aβ42進行了定量檢測。與假手術組相比，MCAO組的同側皮質白質（包括丘腦和內囊）中可溶性Aβ42的水平明顯更高。因此，缺血可能通過增強的tau和Aβ42加劇了hAPP-SL小鼠的神經變性。

綜上，不同于傳統的頸內線栓法制備的MCAO模型可能造成的高死亡率[10]，該模型的優點是較穩定，并且術后小鼠能長期存活，可以模擬MxD的多個特征，但缺點是手術較為復雜，較為費時。

1.3 局灶性皮質下缺血性中風-AD模型

ApoE4-TR：5XFAD轉基因小鼠是5XFAD[APP K670N/M671L（瑞典）+I716V（佛羅里達）+V717I（倫敦）家族性阿爾茨海默氏病（FAD）突變]與突變的人早老素1（PSEN1）的雜交體，其中插入了M146L+L286V FAD突變，通過人載脂蛋白E4（APOE 4）敲入小鼠系[11]。APOE 4是AD的主要遺傳風險因子，促進Aβ生成[12]。在發生重大AD病理之前，Hayden等[13]在2月齡小鼠左腦半球內進行皮質下白質中風或假手術。誘發中風后，在第7、10、15和20周進行新事物識別和24 h恐懼調節實驗；在5月齡時測量腦代謝以及組織病理學。局灶性皮質下缺血性中風模型是通過在左腦前肢運動皮層下方立體定位注射不可逆eNOS抑制劑-N5-亞氨基乙基-1-鳥氨酸[L-N5-（1-iminoethyl）ornithine，L-NIO]完成[13]。與假手術組動物相比，中風的E4-TR：5XFAD小鼠的皮質區域中的淀粉樣斑塊負擔顯著減少，認知能力得到了改善。且位于皮層下區域中的激活的小膠質細胞的數量和形態復雜性增加，表明活化的小膠質細胞和皮質神經元之間的相互作用可能促進了淀粉樣蛋白清除。由于這種皮層下白質缺血模型可以在腦白質中精確地產生局灶性中風損傷，引起局灶性炎癥反應，并導致局部軸突和少突膠質細胞的損失[14]。

皮層下缺血性血管性癡呆是血管性癡呆最常見的亞型，其主要的病理表現為腔隙性腦梗死和腦白質病變[15]。那么，該模型僅損傷皮層下白質軸突，同時允許研究損傷的皮層下部位對與之連接的皮層部位神經元的影響，可能更符合臨床上的實際需求。且該模型采用的5XFAD轉基因小鼠模型，有較強但暫時延遲的淀粉樣蛋白積累速率。使用這種范式，可以研究在hApoE4-TR：5XFAD小鼠發生嚴重淀粉樣變性之前，皮層下白質缺血性癡呆的引入如何改變淀粉樣病變的產生、皮質炎癥、運動恢復和認知障礙。

2 高血壓-AD模型

根據流行病學研究顯示，MxD的主要血管危險因素是年齡、高血壓、高同型半胱氨酸血癥，以及白質高信號[16-17]。為了探索AD與慢性高血壓之間的協同作用，Denver等[18]開發了高血壓-AD大鼠模型，該模型是通過將APPswe/PS1ΔE9轉基因小鼠與易發中風的高血壓大鼠（stroke-prone spontaneously hypertensive，SHRSP）雜交產生的。首先，通過對血壓的監測，表明高血壓傾向是保留在SHRSP/AD交叉中。然后對組織的血管神經，炎癥和AD病理進行評估。結果顯示，SHRSP增加了AD依賴性神經炎癥，表現為小膠質細胞和星形膠質細胞激活和tau病理增多，但斑塊病理變化卻出人意料，表現為更少的斑塊和緊實的核斑，表明斑塊負擔減輕。血管病理學證據包括星形細胞尾足蛋白aquaporin-4分布異常，正常情況下分布在微血管中，但在SHRSP/AD大鼠中，aquaporin-4大部分與血管分離，表現為無組織或重新分布于神經纖維中。腦小血管樣疾病病理的其他證據包括腦血管膠原Ⅳ染色增加和血小板內皮細胞黏附分子-1水平升高。胱天蛋白酶切割的肌動蛋白增加，髓磷脂的損失和神經元中鈣結合蛋白染色的減少。此外，SHRSP/AD存在線粒體缺陷，特別是復合物Ⅱ的喪失，伴隨著AD依賴的線粒體復合物Ⅰ的喪失，都表明了SHRSP/AD大鼠神經元受損。但在新事物識別實驗中，只有AD組表現出識別指數的下降；且在Y迷宮試驗中，也只有AD組表現出進入正確臂次數下降，而SHRSP/AD組盡管進入正確臂次數下降，但無統計學差異。因此行為學數據卻表明引入SHRSP表型并不會加劇FAD大鼠表現出的認知缺陷。

綜上，此模型是基于MxD的危險因素高血壓而做的嘗試，難點在于轉基因動物的雜交培養。

3 糖尿病-AD模型

盡管潛在的機制還尚不清楚，但已知中年肥胖癥和2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）可能會增加AD的風險[19]。以此為契機，Niedowicz等[20]創建了一個新穎的小鼠模型，該模型通過將病態肥胖和糖尿病 db/db 小鼠與 APPΔNL/ΔNLx PS1P264L/P264L敲入小鼠雜交來囊括T2DM和AD的特征。雜交后的小鼠（db/AD）保留了親本系的許多病理特征，如極端肥胖、糖尿病和Aβ的沉積。兩種疾病的結合也導致了其他病理，其中最引人注目的是嚴重的腦血管病理，包括動脈瘤和中風。盡管早老素的總體表達升高，但糖尿病小鼠的皮質部位Aβ沉積并未顯著增加。令人驚訝的是，Aβ沒有沉積在脈管系統中，也沒有移至血漿中，并且沒有刺激主要Aβ清除酶（中性溶酶，胰島素降解酶或內皮素轉化酶）的活化或表達。與db/db或APPΔNLx PS1P264L小鼠相比，db/AD小鼠在Morris水迷宮中顯示出更明顯的認知功能障礙。研究者認為這些小鼠的糖尿病和（或）肥胖癥會導致脈管系統不穩定，導致中風，進而導致嚴重的認知障礙，且這些變化不是直接影響Aβ沉積導致的。

與高血壓-AD模型相似，這種MxD模型基于另一高危因素糖尿病。為研究與肥胖相關的癡呆風險的潛在機制提供了新途徑。同樣雙雜交動物對研究成本的要求上提出更高要求。

4 討論

AD和VaD占癡呆癥診斷的80%以上。尸檢時，約有50%的癡呆患者表現出混合病理特征，即慢性腦血管疾病和AD病理的特征[21]。VaD最常見的神經病理特征是皮層下白質中的局灶性微血管缺血性中風病灶，與AD相似，這些病灶隨時間累積，是進行性損傷的[22]。因此，AD與VaD這些與年齡相關的損傷具有共同的性質，為了理解這兩種病理在神經生物學水平上如何相互作用，關鍵是使用能夠準確反映最常觀察到的病理學的方法進行充分建模。

MxD基于各種的模型研究，漸漸提出了幾種假說來建立腦血管病理學和AD之間的聯系，包括由白質損傷引起的輕度慢性炎癥，導致腦血管清除Aβ的能力受損[23]，以及由APP觸發的軸突分子死亡途徑[24]，最終導致認知功能損傷。眾所周知，心血管疾病增加了AD和MxD的風險，但是如何影響癡呆進展仍然難以捉摸。如在局灶性皮質下缺血性中風-AD模型中，皮質下白質中風反而減少了皮層病灶的淀粉樣斑塊積聚。而在高血壓-AD模型中，行為學數據卻表明引入腦血管病并不會加劇AD大鼠的認知缺陷。且也有研究發現，具有AD病理特征和腦血管病理特征的受試者損傷較少，認知功能下降較慢[25]，以上研究使這些協同損傷作用必然加重認知損傷的簡單解釋變得尤為復雜。這些看似自相矛盾的結果表明，混合病理必然導致淀粉樣蛋白生成加速，進而導致癡呆的普遍假設可能并不完全正確，值得在動物模型中進行更多研究。