石油烴降解菌Pseudomonas sp.及其生物表面活性劑對原油處理效果分析

王衛強， 崔 靜， 吳尚書， 董 美， 張海娟

(遼寧石油化工大學 石油天然氣工程學院，遼寧 撫順 113001)

原油在管道輸送過程中，蠟組分常常會因為環境溫度降低而結晶析出[1]，導致管道輸送半徑變小，情況嚴重會造成凝管停運；此外，若原油黏度過大，則流動性較差，輸送成本大大提高。針對原油輸送過程中所帶來的問題，20世紀80年代，以美國為代表的西方國家將微生物技術應用到石油開采運輸中[2]。微生物能夠以原油中的蠟分子為碳源，其生長代謝過程就是對烷烴的降解過程，削弱蠟晶結構強度，從而降低原油的黏度及蠟含量，提高原油流動性；同時，有些菌株在生長代謝過程中產生生物表面活性物質，易吸附在微小蠟晶表面，防止蠟晶之間互相聚集、長大和沉積，從而起到防蠟作用[3-4]。因此，微生物清防蠟技術在原油開采及運輸過程中具有重要意義。

綜上所述，微生物技術作用于原油中有多方面效果，可以降解原油中的脂肪烴，降低原油凝點、黏度及蠟含量。筆者從受石油污染土壤中篩選出1株能夠降解石油烴類的W12#菌株。對該菌株進行16S rRNA基因序列比對鑒定，測試其是否產生表面活性物質，鑒定細胞表面對烴類的黏附性以及對正十六烷烴的乳化性能；通過菌株與原油作用，測定原油中的蠟含量、黏度及粒徑變化，進一步證明W12#菌株對原油的除蠟降黏作用，以期提高原油流動性。

1 實驗部分

1.1 實驗原料

1.1.1 菌株與原油

從遼河油田附近長期經受石油污染土壤中篩選出1株以液體石蠟為唯一碳源，產生表面活性物質的菌株，命名為W12#。菌株于4 ℃保存。

實驗所用原油取自于遼河油田。

1.1.2 試劑與儀器

胰蛋白胨、MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、NH4Cl、瓊脂粉、三氯甲烷、甲醇、Urea、Tris硼酸(TEB)，均為AR，國藥集團化學試劑有限公司；液體石蠟，CP，國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉，生物試劑，北京奧博星生物技術有限責任公司；NaNO3，AR，天津市恒興化學試劑制造有限公司；正十六烷烴，AR，北京百奧萊博科技有限公司；乙醇，CP，國藥集團化學試劑有限公司；戊二醛，生化試劑BR，國藥集團化學試劑有限公司；裂解液，生物試劑，日本TaKaRa公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，國藥集團化學試劑有限公司；瓊脂糖凝膠，國藥集團化學試劑有限公司；Super DNA Marker(含有Buffer和Marker溶液)，上海研謹生物科技有限公司。

CF-B-10H生化儀配套純水機，四川德立世科技有限公司；SHZ-82水浴恒溫振蕩器，江蘇金壇市環宇科學儀器廠；Z326K高速冷凍離心機，德國賀默公司；Vortex-5渦旋振蕩器，Kylin-bell公司；梯度PCR儀，德國Eppendorf公司；UV-2550紫外分光光度計，上海科恒實業發展有限公司；Q2000 DSC差示熱量掃描儀，美國TA公司；HAKKE流變儀，上海珩璟科技有限公司。

1.1.3 培養基

無機鹽培養基：去離子水1000 mL，K2HPO41 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 5 g，NH4Cl 1 g, NaNO31 g。

Luria-Bertani (LB)液體培養基：超純水1000 mL，胰蛋白胨10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g。

LB固體培養基：由LB液體培養基中添加15%瓊脂得到。

液體石蠟培養基：超純水1000 mL，NaCl 5 g，NH4Cl 1 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，KH2PO41.25 g，K2HPO41.25 g，NaNO32 g，液體石蠟1 mL。

PUM緩沖液：超純水1000 mL，K2HPO422.2 g，KH2PO47.26 g，Urea 1.8 g，MgSO4·7H2O 0.2 g。

以上培養基的制備條件：壓力,0.105 MPa；溫度,121 ℃；時間,20 min。

1.2 W12#菌株代謝產物——表面活性物質的分析

1.2.1 排油圈實驗

排油圈實驗可以比較直觀地反映樣品的表面活性能力[11]。排油圈法中常使用油相有橄欖油、機用柴油和液體石蠟[12]。這些油相與水相顏色差別不大，效果圖不明顯。筆者對排油圈檢測方法進行了改進，改進后以原油為油相。將W12#菌發酵液經離心機離心，取100 μL上清液備用；取30 mL的超純水置于90 mm的培養皿中，滴入1 mL已預熱到40 ℃的原油，當原油均勻地平鋪在水面形成一層薄膜之后，滴加上清液，觀察是否產生排油圈，若產生排油圈，則表明W12#菌株產生表面活性物質[13]。

1.2.2 W12#菌株對石油烴的黏附性(BATH)測試

BATH測定法用于測量菌株對正十六烷作為底物的細胞表面疏水性[14]，表示細胞對疏水性的黏附百分比。借鑒Zhou等[15]和Bharali等[16]對細胞疏水性的測定方法，并根據實驗需求進行改良。

將W12#菌株培養至對數期后，取其發酵液經離心機離心，去除上清液，得到已分離出的細胞；加入PUM緩沖液對細胞外物質進行清洗，搖勻，獲得菌懸液，備用。以PUM緩沖液為空白，將菌懸液的光學密度(OD400 nm)調試至(0.3～0.6)。取 1 mL 的菌懸液于1.5 mL離心管中，加入0.2 mL的正十六烷烴至離心管中，于25 ℃下溫育5 min，劇烈振蕩60 s，室溫靜置1 h后進行相分離，用移液槍快速從離心管菌懸液層吸取200 μL于比色皿中，采用UV紫外分光光度計在400 nm的波長下測量菌液的光學密度OD。通過測量菌懸液初始的光密度值以及處理后菌懸液的光密度值，計算生物體的細胞表面疏水性y。

y=(1-a/b)×100%

(1)

式中：y為細胞疏水性，%；a為初始菌液的OD400 nm值；b為終末菌液的OD400 nm值。

1.2.3 W12 #菌株對烷烴的乳化實驗

根據Parhamfar等[17]的實驗經驗對測量表面活性物質的乳化活性進行改進。取4 mL液體石蠟和等體積的菌發酵液上清液置于離心管中，渦旋振蕩器充分振蕩2 min，25 ℃條件下靜置24 h。采用式(2)計算乳化指數(Emulsification index，E24)[18]。

(2)

式中：h為乳化層高度，cm；H為混合液體總高度，cm。

1.2.4 W12#菌株代謝產物的鑒定

將10 mL已培養的菌發酵液置于高速冷凍離心機，4000 r/min條件下離心20 min，取出上清液，溶于10 mL三氯甲烷與甲醇混合液(V(三氯甲烷)/V(甲醇)=2/1)中進行萃取。將萃取后的液體置入44 ℃的烘箱中烘干，稱取烘干后樣品的質量，即為W12#菌株代謝產物的質量。將1 mg代謝產物與100 mg KBr混合研磨，壓片，通過THermo公司的iS10傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1波數內檢測。

1.3 W12#菌株形態結構觀察及鑒定

1.3.1 W12#菌株形態結構觀察

在LB固體培養基中進行平板劃線，觀察菌落形態。

將W12#菌發酵液經高速冷凍離心機離心分離出菌株，采用日本日立公司的S-4800掃描電鏡觀察菌株形態。掃描電鏡樣品制備前期工作[19]：取2 mL的菌發酵液在1000 r/min下離心分離，去除上清液，使用pH值7.2～7.4的0.1 mol PBS緩沖液清洗2次，每次15 min；菌株經清洗后立即加入戊二醛溶液(V(戊二醛)/V(水)=2.5/97.5)內固定4 h，用V(乙醇)/V(水)分別為30/70、50/50、70/30、80/20、90/10的乙醇溶液對樣品進行脫水，不同體積比乙醇溶液脫水 15 min；在乙醇中脫水2次，每次15 min；第2次做真空冷凍干燥24 h。

1.3.2 W12#菌株鑒定

取50 μL裂解液置于離心管中，從LB平板上取W12#菌株加入離心管中，密封，離心，置于恒溫水浴鍋中，在80 ℃下加熱15 min，取出，再微離心。以16S rDNA為目的基因，設計通用引物進行PCR擴增，擴增在Mastercycler上進行。

正向引物為27F，反向引物為1492R。聚合酶鏈反應(PCR)的反應體系如表1所示。反應條件如表2所示，其中變性(Denaturation)、退火(Annealing)、延伸(Extension)過程循環30次。

用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠置入25 mL TBE溶液，振蕩均勻，置于微波爐中加熱2 min，倒入已經插好梳子的配膠槽中，冷卻30 min。將PCR 產物取出，準備Marker溶液；將膠板取出，置入電泳儀；用移液槍取6 μL Buffer溶液均勻滴成2個點，取5 μL Marker溶液加入第1個點，第2個點加入5 μL PCR產物，即3 μL Buffer+5 μL Marker/PCR 產物。取各點溶液吹打均勻后加入凝膠板孔中，打開電泳儀，電泳30 min。通過電泳檢測確定目的片段長度，將PCR擴增產物交由上海美吉生物醫藥科技有限公司進行16SrDNA測序。通過Blast軟件將獲得的基因序列與GenBank中的核酸序列進行相似性比較，用MEGA 7.0構建系統發育樹[20]。

表1 聚合酶鏈反應體系Table 1 PCR system

表2 聚合酶鏈反應條件Table 2 PCR reaction conditions

1.4 W12#菌株對原油處理效果檢測

將W12#菌株以3%的接種量接種于100 mL的基礎培養基中，加入50 mL的原油，置于水浴恒溫振蕩器中振蕩培養7 d，測定原油蠟含量、黏度與分子粒徑的變化。實驗環境：40 ℃，150 r/min。

2 結果與討論

2.1 W12#代謝產物——生物表面活性劑的分析結果

2.1.1 排油圈實驗結果

將W12#菌株的上清液加入到油膜中，油膜向四周排開，結果如圖1所示。通過Nano measure測量所得，排油圈直徑為57.47 mm，證明W12#菌株代謝產生表面活性物質，可提高原油中不溶性化合物的溶解度，增加菌株與原油接觸面積[21]。

2.1.2 W12#菌株對正十六烷烴的黏附性

細胞表面疏水性是決定碳氫化合物與細胞表面黏附性的主要因素。實驗結果表明，W12#菌株的細胞表面疏水性為89.55%，說明該菌株具有非常高的表面疏水能力，對原油的親和力高于對水親和力，對烴的黏附性較強[22]，易附著于疏水性物質表面。這有助于微生物在疏水性底物上生長并提高其生物利用度[23-25]，從而有利于改善儲層和地面設施的烴降解。與Mishra等[26]所研究銅綠假單胞菌在加入十六烷烴的無機鹽培養基中的細胞疏水性的結果相一致。

圖1 排油圈Fig.1 Oil-displacement activity(a) Untreated oil sample;(b) Oil spreading enclosure formed by W12 #

2.1.3 W12#菌株對烷烴的乳化作用

W12#菌株與液體石蠟混合，靜止24 h后可觀察到明顯穩定的乳化層，結果如圖2所示。

圖2 W12#菌株乳化效果Fig.2 Emulsification effect of the strain W12#(a) Untreated sample； (b) After treatment by W12#

通過式(2)計算E24，W12#菌株的乳化層高度及E24如表3所示。由表3可知，W12#菌產生的表面活性物質具有良好的乳化性能，可將石油烴乳化到基質中，并形成穩定的乳狀液，使菌發酵液與石蠟充分接觸，加快石蠟降解[27]。

2.1.4 代謝產物鑒定

W12#菌株代謝產生的表面活性物質的紅外吸收光譜如圖3所示。由圖3可知，W12#菌株代謝產生的表面活性物質中存在糖脂的典型峰。3144.16 cm-1為N—H鍵的伸縮振動峰；2923.73 cm-1和2858.57 cm-1為脂肪族的—CH2—的對稱拉伸振動；1642.89 cm-1為酰胺的CO—N鍵拉伸振動，屬于脂肽；1389.25 cm-1處為—CH3基團做不對稱形變振動；1154.85 cm-1處為糖環縮醛結構C—O—C的振動;證實糖脂存在。971.75 cm-1為C—O鍵伸縮振動造成。與Sakthipriya等[28]實驗結果相一致，證明W12#菌株代謝產生的表面活性物質為糖脂類。

表3 W12#菌株的乳化能力測定Table 3 Determination of emulsification capability of W12#

圖3 W12#菌株代謝產物的紅外吸收光譜圖Fig.3 FT-IR spectrum of metabolites of the strain W12#

2.2 W12#菌株的形態觀察及鑒定結果

2.2.1 W12#菌株的形態觀察

W12#菌株的形態如圖4所示。由圖4(a)可見，W12#菌株在LB固體培養基中的生長情況，在LB固體平板上，菌株W12#呈油滴狀，米黃色，表面光滑。由圖4(b)可知，W12#菌株呈長桿狀，無鞭毛，邊緣光滑濕潤，大小為(0.5～0.7) μm×(3～3.5) μm。

圖4 W12#菌形態Fig.4 Morphology of W12# strain(a) Colony morphology on LB medium； (b) SEM image

2.2.2 W12#菌株16S rRNA鑒定結果

經過16S rRNA測定，W12#菌株的目的基因片段長度為1050 bp。經過與NCBI數據庫進行BLAST對比可知，該菌株屬于假單胞菌(Pseudomonassp.)，其GenBank序列號為MF948933.1，同源性達到99.9%。W12#菌系統發育樹如圖5所示。

圖5 菌株W12#的系統進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of W12#

2.3 W12#菌株對原油作用效果分析

2.3.1 W12#菌株對原油中蠟的影響

采用差示掃描量熱儀測定經W12#菌株處理后原油的含蠟量、析蠟點[29]，結果列于表4。由表4可知，經W12#菌株作用后，原油的析蠟點、析蠟峰點和析蠟潛熱均下降，原油的蠟含量降低。W12# 菌株能夠以原油中的長鏈烷烴為碳源進行生長代謝，長鏈烷烴的減少有助于削弱蠟析出后形成的蠟晶網狀結構強度，從而使原油中的蠟含量降低；同時，W12#菌株在代謝過程中產生表面活性物質，吸附在蠟晶表面上，增加蠟晶表面的疏水性，不利于蠟晶積聚，使蠟晶保持細小狀態，阻止或減弱微小蠟晶之間互相聚集、長大和沉積，從而起到防蠟作用[30]。

表4 原油經W12#菌株處理前后蠟的變化Table 4 Wax changes of the oil sample with W12# treatment

2.3.2 W12#菌株對原油黏度的影響

采用流變儀對W12#菌株處理前后原油黏度進行測量，原油黏度變化及降黏率如圖6所示。由圖6可見，在W12#菌株處理前，原油非牛頓流體溫度段的黏度范圍為7.49～78.98 mPa·s；處理后，該溫度段黏度范圍下降至4.9～50.47 mPa·s，原油降黏率隨溫度升高而提高，當溫度達到40 ℃時，原油降黏率最高，為63.75%。而當溫度高于40 ℃時，原油降黏率開始降低，黏度變化甚微。20～40 ℃溫度范圍內，原油屬于非牛頓流體，此時，菌株隨溫度升高而生長能力增強，因此對原油處理效果增強；而當溫度高于40 ℃時，超過菌株生長的最適溫度范圍，高溫破壞菌株的細胞結構，使菌株失活，對原油處理效果降低。溫度本身會對原油黏度產生影響，當溫度升高時，原油黏度降低，但是下降幅度偏小。

圖6 原油經W12#菌株處理前后黏度變化及降黏率曲線Fig.6 Profiles of viscosity changes and viscosity reductionratio for the crude oil treated with W12#Shear rate: 27 s-1

微生物影響原油黏度，一方面是因為微生物在生長過程中利用石油中的長鏈烴作為碳源，將原油中的大分子烴轉化為小分子烴，降低原油黏度[7,31]；另一方面，菌株在代謝作用下產生的表面活性物質有潤濕及乳化作用，乳化原油中烷烴分子，可以降低原油的黏度，增加其溶解度，改善原油的流動性[28,32]。

2.3.3 W12#菌株對原油組分粒徑的影響

采用FBRM監測原油經W12#菌株處理后形成O/W乳狀液分散相的粒徑分布變化。為了排除溫度因素對蠟晶的干擾，考慮到選用的溫度應高于原油析蠟點，最終本次實驗溫度設定為50 ℃[33-34]。

原油經W12#菌株處理前后的分散相粒徑分布變化如圖7所示。由圖7可見，經W12#菌株處理后，原油在40～60 μm區間的粒徑所占的比率均低于2%；在60～100 μm區間的粒徑所占比率最少，且均不超過1%；處于1～50 μm區間的粒徑大幅度增加，最高比率達到8%，遠遠高于對照油樣。而大于50 μm的粒徑所占的比率由原來的3%降為1.5%，尤其是在60～100 μm區間的粒徑，其長鏈烴幾乎被完全降解。

圖7 原油經W12#菌株處理前后的粒徑分布Fig.7 Chord length distribution of the crude oil before andafter W12# treatmentTemperature: 50 ℃; Rotation rate: 300 r/min

這一方面是由于微生物的直接降解，將原油中的大分子烴降解成小分子烴，使原油的粒徑尺寸減小；另一方面，微生物代謝產生表面活性物質，對石油烴類物質起到增溶分散的作用[35-36]，使得石油烴類物質乳化成更細小的顆粒，更利于微生物的附著降解。

3 結 論

(1)從遼河油田石油污染土壤中篩選出一株能夠除蠟降黏的W12#菌株，經16S rRNA進行測定，該菌株為假單胞菌。

(2)W12#菌株在生長代謝時產生表面活性物質，能夠形成排油圈；W12#菌株疏水性高達89.55%；W12#菌株和液體石蠟混合后，形成明顯穩定的乳化層，乳化指數為62.5%。經傅里葉紅外光譜測定，代謝產物為糖脂類物質。

(3)原油經W12#菌株處理后，析蠟點、析蠟峰點以及析蠟過程中釋放的析蠟潛熱均降低；同時，蠟含量明顯降低，除蠟率為34.66%；原油在 20～40 ℃ 黏度由7.49～78.98 mPa·s降低至4.9～50.47 mPa·s，在40 ℃下，原油降黏率達到63.75%； W12#菌株可以起到除蠟降黏提高原油流動性的作用。