153例多發性骨髓瘤的細胞遺傳學分析

徐凱紅， 牧啟田， 歐陽桂芳， 嚴 笑

（寧波市第一醫院血液科，浙江 寧波 315000）

多發性骨髓瘤（multiple myeloma ，MM）是一種不可治愈的血液系統常見腫瘤，臨床表現為不同程度的貧血、腎功能不全以及骨痛，總生存時間（overall survival，OS）一般為2～10年[1]。有研究結果表明，基因組在MM的發生和發展中起著至關重要的作用[2]。細胞遺傳學異常，如t（4；14）、del（17/17p）、t（14；16）、t（14；20）、非超二倍體等與MM預后不良相關，而t（11；14）通常預后較好[3]。因此，細胞遺傳學異常已成為MM危險分層中最重要的部分，對預后和治療方案的選擇有重要指導作用。

近年來的新興檢測技術，特別是二代測序（next-generation sequencing，NGS）技術的出現，使細胞遺傳學分析具有更高的靈敏度和通量[4]。常規核型分析在MM細胞遺傳學和危險分層中的作用似乎正在減弱[5]。本研究回顧性分析了153例MM患者的細胞遺傳學異常情況，評價細胞遺傳學分析在MM中的應用價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2015年10月—2018年10月經國際骨髓瘤工作組標準被確診為MM的153例患者作為研究對象，其中男91例，女62例，年齡47～84歲，包括IgG型87例（56.9%）、IgA型32例（20.9%）、輕鏈型27例（17.6%）、不分泌型4例，IgD型3例，國際分期系統（international staging system，ISS）分期Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ分別為36例、65例和52例。對所有對象的骨髓標本進行常規R顯帶和間期熒光原位雜交（interphase fluorescencein situhybridization，iFISH）分析。所有患者選用以velcade為基礎的誘導治療，48例（31.4%）隨后進行自體造血干細胞移植，其他105例患者由于無法耐受，接受非強化治療。本研究經寧波市第一醫院倫理委員會批準并取得患者知情同意。

1.2 染色體核型分析

骨髓細胞染色體核型分析采用常規R顯帶。加入秋水仙堿使其終濃度為0.1 ng/L，孵育50 min。用氯化鉀溶液進行低滲處理并用甲醇冰醋酸混合液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）固定，細胞懸液制片后熱處理變性，最后染色觀察。至少觀察20個有絲分裂，核型描述按照《國際人類細胞遺傳學命名系統》[6]進行。將染色體數目≥47且＜75定義為超二倍體，將亞二倍體、假二倍體和近四倍體定義為非超二倍體[7]。

1.3 iFISH分析

對CD138純化的骨髓細胞進行iFISH分析。選擇5個特異的DNA探針：針對17p13.1的LSI-TP53探針（美國雅培分子公司）、針對13q14不同位點缺失的LSI-RB1和LSI-D13S319探針（美國雅培分子公司）、針對14q32的LSI-IGH雙色分離重排探針（美國雅培分子公司）、針對1q21擴增的1q21探針（廣州LBP醫藥科技有限公司）。探針和標本DNA在73 ℃下變性5 min，用10 μL 6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，4'，DAPI）（德國羅氏公司）進行細胞核復染。每個探針至少分析200個間期細胞。所有iFISH探針均采用陰性和陽性對照進行驗證，當陽性信號百分比超過閾值時，則判定為陽性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計分析。采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗進行比較，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 染色體核型分析結果

對153例MM進行染色體核型分析，染色體異常的檢出率為28.1%（43/153）。69.8%的患者（30/43）同時存在數量和結構上的異常（圖1）。單純的染色體數目異常多見于超二倍體，而單純結構異常則僅見于非超二倍體（表1）。

圖1 異常染色體核型

表1 MM常規核型分析結果 例

細胞遺傳學異常主要集中在13號染色體（20/43，46.5%），其次是9、14、1號染色體（19/43，44.2%）和8號染色體（18/43，41.9%）上。染色體數目增加最常見于9號染色體（17例，39.5%），其次是5號和15號染色體（各10例，23.3%）；染色體缺失最常見于8號染色體（9例，20.9%），其次是13號染色體（7例，16.3%）和14號染色體（6例，14.0%）；染色體結構異常最常見于1號染色體（15例，4.9%），其次是14號染色體（10例，23.3%）和13號染色體（9例，20.9%）。見圖2。

圖2 43例MM核型異常在具體染色體中的分布

2.2 iFISH檢測分析

采用5種常規探針，iFISH共檢出109例（71.2%）異常，其中最常見的異常是IGH重排，占55.6%（85例）；其次是1q21擴增（82例，53.6%）、RB1缺失（64例，41.8%）、D13S319缺失（60例，39.2%）、TP53缺失（21例，13.7%）。其中，探針LSI-RB1和LSID13S319與13914雜交，2個位點缺失頻率無顯著差異（P＞0.05）。iFISH檢出只有1種異常的患者僅23例（21.1%），其他108例患者均同時出現2～5種異常。見圖3和圖4。

圖3 iFISH檢出的5種細胞遺傳學異常

圖4 iFISH檢出的5種細胞遺傳學異常的分布

在153例MM患者中，R顯帶和iFISH聯合應用可使細胞遺傳學異常的檢出率提高到79.1%（121/153）。121例檢出細胞遺傳學異常的患者中，9例MM患者R顯帶檢出核型異常，但iFISH陰性（表2），占所有細胞遺傳學異常患者的7.4%（9/121）。對9例患者隨訪至2020年1月10日，中位隨訪時間為3.1年（隨訪1.3～4.2年），其中有2例仍處于平臺期，其他7例無疾病進展時間（progression-free survival，PFS）均＜3年，其中包括2例死于感染和心力衰竭的患者。

表2 9例iFISH檢測陰性的MM患者核型

3 討論

MM是一種基因復雜的腫瘤性疾病。細胞遺傳學技術的最新進展表明，幾乎所有的MM患者都存在細胞遺傳學的異常[8]。新的分子細胞遺傳學技術，尤其是NGS技術，雖然可以提供更多關于細胞遺傳學的信息，但由于成本高、缺乏統一規范等，導致應用受到限制。iFISH是目前臨床上應用最廣泛的細胞遺傳學檢測方法，是危險分層和預后的主要基礎[9]。

在本研究中，iFISH異常的檢出率與文獻[10-11]相似，本研究使用探針LSI-RB1（13q14.1-14.2）和LSI-D13S319（13q14.3）與13q14雜交，2個位點缺失頻率無顯著性差異（P＞0.05）。而且，本研究共有30例（34.9%）RB1和D13s319同時缺失，統計學分析證實這2個位點高度相關（r=0.966）。這一結果說明，MM 13號染色體的異常多表現為13q的大片段缺失或整條13號染色體的缺失 。臨床上可只選取LSI-RB1或LSI-D13S319探針中的1種來檢測13q14的缺失。

在本研究中，MM染色體核型分析的檢出率與文獻報道相似[12-13]，且細胞遺傳學異常主要集中在13號染色體，其次是9、14、1號染色體和8號染色體上。有研究證實13號染色體缺失、14號染色體IGH重排、1q21擴增和8號染色體畸變在MM發病機制中具有重要價值[14]，與本研究發現的遺傳學異常好發染色體一致。本研究還發現9號染色體的異常，且+9出現頻率較高。有研究者推測，位于9p21上的p16和p15抑癌基因拷貝數的增加，可能會使MM有良好的預后[15]，但對9號染色體的研究尚未見深入報道。由于超過1/3的MM患者存在9號染色體異常，且其生物學機制尚不清楚，值得進一步研究。

iFISH結合染色體核型分析，細胞遺傳學異常檢出率可達79.1%。盡管iFISH在揭示遺傳學異常方面有很高的效率，但本研究中核型分析異常的患者中仍有7.4%（9/121）的患者iFISH檢測陰性。iFISH的效率很大程度上取決于探針的組成。雖然，使用足夠多的探針幾乎可以識別所有的細胞遺傳學異常，但是成本會大大增加。在臨床實踐中，iFISH探針只針對發病率較高或有預后意義的重復性異常，因此檢出效率受到影響。由于隨訪時間的限制，無法統計出所有的OS，我們統計了這9例患者的PFS，發現其中7例患者PFS＜3年；第1例和第2例伴有+3和/或+5的超二倍體，根據常規判斷，本該有良好的預后[15]，短期出現了疾病進展可能是由于出現+21和≥2個額外的結構染色體異常，文獻報道可導致較差的臨床預后[16-17]。第3例和第4例患者也均為超二倍體，但同時伴有8號染色體異常。研究證實，8p21的缺失可導致MM患者對硼替佐米耐藥，還可能導致相關基因（TRAIL-R4、CCDC25、RHOBTB2、PTK2B、SCARA3、MYC、BCL-2和TP53等）表達譜的改變，這些基因的表達與MM的發生、發展有重要關系[18]。染色體8q24.1/c-myc異常也被認為是高危骨髓瘤的一個標志[19]。本研究也證實8號染色體是細胞遺傳學異常最集中的染色體之一，這些研究結果一定程度上解釋了本研究第3例和第4例患者預后欠佳的原因，其他5例均存在意義未明的結構異常，由于沒有商品化的iFISH探針，因此無法進行檢測。我們還發現大多數（78.9%）iFISH陽性患者具有2種及以上異常，染色體核型分析也顯示，69.8%的MM同時存在染色體數量和結構異常，這提示MM的預后是多基因共同作用的復雜細胞遺傳學結果。當細胞遺傳學上預后良好和預后不良的特異性改變同時出現時，具體臨床表現以哪一方占主導地位，尚需進一步探討。

綜上所述，盡管核型分析在MM的細胞遺傳學分析中效率不高，但其能夠提供MM完整的細胞遺傳學信息，揭示商品化iFISH探針無法檢出的位點。大規模的染色體核型分析，有助于確定染色體上特定的位點，為進一步的MM分子發病機制和化療靶向位點的研究提供參考。