細胞外囊泡檢測技術及其臨床應用進展

劉春辰， 林慧嫻， 鄭 磊

（南方醫科大學南方醫院檢驗科，廣東 廣州 510515）

細胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是細胞分泌至胞外的一種含脂質雙分子層的膜性囊泡，依據其形成機制與直徑差異，可分為外泌體、微囊泡與凋亡小體三大亞群，EV內含特異性蛋白質、活性核酸和脂質，有望成為揭示疾病發生機制和應用于臨床診療領域的一種新型標志物[1]。在機體中，EV以非均一膜性囊泡的結構廣泛散在于各類體液中，包括血漿、血清、唾液、乳汁和尿液等[2]。作為“液體活檢”的后起之秀，EV豐度遠高于循環腫瘤細胞，且受膜形式的保護，其內容物穩定性較好，克服了體液樣本中ctDNA易降解等弊端[3]。相對于組織病理檢查，基于血液等樣本的EV檢測具有無創、取樣簡便等優勢，患者依從性更高，便于病情監測，易于及時調整治療方案；與傳統血清游離核酸與蛋白標志物檢測相比，EV檢測具有靶向性顯著、信息量更豐富、檢測基質干擾小等優勢[4-5]。因此，EV對疾病的早期診斷和療效監測有重要的臨床價值。本文對目前常用的EV分離富集和鑒定技術，以及EV不同內容物的檢測技術的優缺點和臨床應用進行綜述。

1 EV分離富集技術與檢測

基于EV大小、密度等物理性質及其特有的蛋白質生物學特性，去除體液樣本中雜質蛋白、脂質等復雜成分的干擾，實現EV的分離富集，是其內容物準確分析的前提。EV分離富集的回收率、純度及其活性直接影響著EV后續鑒定與內容物檢測。目前EV常用的分離富集技術及其優缺點見表1。超速離心法是目前被廣泛認可的EV分離富集的金標準。TIAN等[6]對包括超速離心法在內的尺寸排阻色譜法等6種EV分離富集技術進行了EV純度與分離效率的綜合評估，證實超速離心法分離所得的EV純度最高，可有效用于后續內容物的檢測和分析。

2 EV鑒定分析技術與檢測

鑒于體液樣本成分的復雜性，體液樣本中存在許多干擾EV檢測的物質，包括某些蛋白質和顆粒性組分，且部分雜質在大小與密度上與EV存在重疊，如脂蛋白等，可能會與EV共分離。為保證EV的準確檢測，同時也為了保證不同研究結果的可信度與可重復性，有必要對分離出的EV進行鑒定。依照國際細胞外囊泡協會（the International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）發布的EV研究最低要求國際研究指南的要求，應對EV進行形態學特征、濃度、粒徑等非特異性鑒定和特定蛋白質分子的特異性鑒定，可累加EV內組分的拓撲鑒定[7]，為后續EV的準確檢測提供必要保障。具體鑒定技術見表1。

表1 EV常用的分離富集與鑒定技術及其優缺點

3 EV內容物檢測技術

EV可選擇性包裹活性核酸、蛋白質和脂質，運載眾多信號分子，經胞膜直接融合、配體-受體特異性結合以及胞吞等方式與靶細胞結合，通過釋放其內容物發揮特定的生物學作用。因此，EV內容物的檢測和分析是剖析EV功能的關鍵環節，對揭示EV在疾病中的具體作用機制及EV的臨床應用具有重要意義。目前，基于EV的臨床診斷技術的開發也大多聚焦于不同亞群特異性內容物的檢測，主要包括核酸、蛋白質，以及以脂質為代表的代謝分子三大領域。

3.1 核酸檢測

EV的核酸內容物包括RNA[mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和其他非編碼RNA等]及DNA[21]，目前以RNA類的研究居多，主要反映EV實行具體功能的轉錄及其調控層面的信息。

針對RNA類內容物，傳統的檢測技術包括瓊脂糖凝膠電泳、免疫印跡法、聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）（熒光定量PCR[22]、液滴式數字PCR[23]）以及芯片技術、二代測序技術[22]等。其中芯片技術與測序技術適用于對樣本的RNA進行高通量檢測，主要用于疾病特異性標志物的篩選。PCR的靈敏度高，但易發生偏性擴增，應避免因污染而產生的假陽性現象；同時，受引物合成技術的限制，PCR只能對已知序列的特定RNA進行分析。

近年來，一系列針對EV的RNA內容物的新型檢測平臺被開發出來，檢測原理呈多樣化趨勢，其中以熒光探針類研究居多，融合了納米技術、微流控技術，以及仿生學等不同學科的技術優勢。基于多色熒光PCR的EV-lncRNA分析芯片[24]和功能化金納米熒光探針[25]均可通過熒光直接實現對靶RNA的高效檢測；其中功能化金納米熒光探針可實現外泌體miRNA-1246的原位檢測，可區分乳腺癌人群與健康人群。部分平臺則先通過疾病相關的特異性蛋白分子對靶外泌體實現捕獲，再檢測其RNA內容物，進一步提高特異性。YANG等[26]設計的免疫生物芯片通過靜電作用將含分子信標的陽離子脂質體與捕獲的外泌體融合，隨著分子信標的注入實現miRNA-21和TTF-1 mRNA的高效檢測，可用于肺癌診斷。近期有研究報道的匯集了仿生學優勢的微流控芯片——NanoVilli芯片，可有效提升肺癌EV中RNA的檢測靈敏度和特異性[27]。以上EV核酸檢測技術的總結與應用見表2。

3.2 蛋白質檢測

EV富含蛋白質類標志物，如熱休克蛋白、膜聯蛋白、整合蛋白、黏附分子、信號轉導因子等[21]。蛋白質作為生物學功能的主要執行者，其攜帶的翻譯后分子水平信息，相對于核酸攜帶的轉錄水平信息，更契合EV的功能狀態，并可更直接地反映這一狀態。

傳統的檢測方法，如免疫印跡法[28]、ELISA[29]、流式細胞術[30]及質譜[31]等可對EV中的蛋白質類內容物進行定性和/或定量檢測。免疫印跡法和ELISA基于抗原-抗體特異性結合的原理，特異性好，但其受抗體制備技術的限制，且針對的僅是樣本總蛋白層面的特定蛋白分子；傳統的流式細胞術無法對小于200 nm的粒子進行分析，限制了流式分析的在EV檢測中的應用。近年來，傳統流式細胞術的改進[32]和高敏流式細胞術[33]的出現，大大提高了儀器的檢測性能，使單個EV水平的多參數分析成為可能。質譜[20]作為一種高通量技術，可同時檢測EV的多種蛋白質標志物，具有靈敏度高、分析速度快等優勢。

蛋白質標志物作為剖析EV功能的重要組分，對其檢測的靈敏度、特異性及臨床有效性要求日益提升。近年來，不同原理的新技術平臺逐漸被應用于EV的蛋白質檢測中，并逐步用于臨床疾病的診療、病情監測及預后評估等。陳賢華等[34]構建的外泌體雙膜蛋白共表達檢測平臺，先用修飾有CD63抗體的磁珠實現外泌體的捕獲，再聯合適配體特異性結合與發夾催化自組裝信號放大技術（catalytic hairpin assembly，CHA）實現外泌體膜上的CD63和上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）2種蛋白質標志物的同時檢測，可用于區分乳腺癌來源和正常乳腺上皮來源的外泌體。LIU等[35]報道了一種新技術——液滴數字外泌體酶聯免疫吸附試驗（exosome-counting enzyme-linked immunosobent assay，ExoELISA），該技術通過抗原-抗體特異性結合原理捕獲表達磷脂酰基醇蛋白聚糖-1（glypican-1，GPC-1）的外泌體，并形成酶促分子標記的ELISA夾心復合物，固定于磁性微珠上，最后將其包裹進液滴中，實現了對靶外泌體的絕對定量。此外，集適體結合與滾環擴增技術于一體的熒光生物傳感平臺[36]、融合了聲學傳感優勢的納米金標記放大表面聲波（surface acoustic wave，SAW）傳感器[37]，以及電化學領域的Aptasensor[38]、微流控領域的Exodisc-B/P[39]等技術，在檢測EV的靈敏度與特異性方面均有明顯提升，部分檢測平臺已可用于疾病的診斷、預后評估等。以上新技術的總結見表2。

3.3 脂質檢測

除活性核酸與蛋白質外，EV中還含有以脂質為代表的一系列代謝分子，包括膽固醇、神經酰胺、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）等[21]。目前，針對脂質的檢測方法相對較少，主要為脂質組學和代謝組學方法，如全反射傅里葉變換紅外光譜[40]、熒光測定法（使用DiR等親脂性熒光染料）[41]、薄層色譜法、高效液相色譜法及高通量質譜[42]等。SMITH等[43]利用拉曼光譜以及主成分分析技術發現癌性與非癌性細胞系衍生的外泌體在膽固醇與磷脂的相對表達上存在差異，提示外泌體中的脂質有成為腫瘤標志物的潛力[43]。還有研究者通過高通量質譜技術對前列腺癌患者及健康人尿液樣本中的外泌體脂質進行檢測，發現PS（18：1/18：1）與乳糖神經酰胺（lactosylceramide，LacCer）（d18：1/16：0）等9種脂質水平存在差異，其中LacCer（d18：1/16：0） /PS（18：1/18：1）比值與PS（18：0-18：2）/PS（18：1/18：1）比值聯合檢測區分前列腺癌患者與健康人的敏感性為93%、特異性為100%[42]。相關檢測技術及其應用見表2。

表2 EV內容物檢測新技術

4 總結和展望

EV作為一種蘊含豐富生物信息的循環標志物，廣泛散布于各類體液中，且受脂質雙分子膜的保護，內容物穩定，因此在豐度以及穩定性上具有明顯優勢，在疾病的早期診斷、病情動態監測及預后評估等方面均具有巨大的應用前景。近年來，各類新型檢測平臺的不斷被開發出來，在靈敏度、特異性及檢測時間上的性能均明顯提升，對EV內容物（核酸、蛋白質與脂質等）有了更深入的研究，并開始關注單個EV水平的檢測，突出其異質性，這有利于對EV進行更深入、更精準的功能分析，進一步推動EV的臨床應用進程。然而，目前仍存在許多復雜因素，使EV檢測應用于臨床疾病的精準診療面臨諸多挑戰，如EV在樣本采集及保存過程中是否存在影響其檢測結果的因素尚不得而知，檢測的靈敏度、特異性、經濟成本等方面如何平衡亦值得思考。此外，EV檢測技術尚缺乏統一的標準操作指南，臨床統一的參考區間仍處于空白，質量控制體系亦不完善，各平臺的檢測結果難以進行橫向比對，結果溯源鏈缺乏，這些問題均限制了EV的臨床應用。未來，研究者們應致力于充分發揮聲學、光學、電磁學、機械自動化以及納米技術等多學科優勢，促進EV檢測平臺向微型化、自動化和便捷化發展，同時完善EV的質量控制體系，加快相應參考區間的建立，以加速推進EV檢測的臨床應用進程。