刺五加多糖對小鼠免疫功能的影響

翟旭楠，劉永武，張娜，趙良友，杜兆遠，范卓文

(黑龍江中醫藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

刺五加為五加科植物刺五加[Acanthopanaxsenticosus(Rupr.et Maxim.)Harms]的干燥根和根莖或莖[1]。由于對生長環境要求低、耐寒、種植技術簡單等原因，所以刺五加廣泛分布于我國東北、華北及小興安嶺等地區[2]。刺五加富含活性物質，可以增強人體活力并調節新陳代謝。同時刺五加還具有治療厭食和失眠的作用[3]。多糖廣泛存在于天然高分子化合物中，主要分布于動植物及微生物的細胞壁中[4]。植物多糖是植物自身新陳代謝中產生的，具有來源清楚、毒副作用小、分布廣泛、功能多樣等優點，被廣泛應用于醫療保健、畜牧生產、食品加工等方面[5]。中藥多糖普遍存在于菌類、藻類等藥材中，研究表明中藥多糖具有增強機體免疫力、降低血糖、抗腫瘤、抗氧化、調節血脂等生物活性[6-8]。刺五加多糖是刺五加的有效活性成分之一，由葡萄糖、果糖、阿拉伯糖等組成[9]。本實驗通過碳粒廓清實驗考察刺五加多糖對吞噬細胞的吞噬作用，并進行溶血素抗體實驗,對刺五加多糖的免疫調節作用進行了初步探討。

1 材料

1.1 儀器

電子分析天平(上海精科天美貿易有限公司)；微量移液器(德國Eppendorf公司)；EDTAK2真空采血管(山東康華醫用耗材有限公司)；一次性真空采血管(揚州市華威醫療器械有限公司)；RT-600全自動酶標儀(美國Rayto雷杜公司)；雷勃爾LD25-2離心機(北京醫用離心機廠)。

1.2 藥品及試劑

刺五加多糖(西安小草植物科技有限責任公司，批號：XC20130515)；印度墨汁(德制Chroma牌，80 mg碳粒/mL)；綿羊紅細胞(石家莊華瑞創新生物技術開發中心，批號：20141117)；都氏液(石家莊華瑞創新生物技術開發中心，批號：201409)；胸腺五肽(北京雙鷺藥業股份有限公司，批號：20058462)；環磷酰胺(天津市廣成化學試劑有限公司，批號；201610068)；Na2CO3(天津市廣成化學試劑有限公司)；生理鹽水(天津市廣成化學試劑有限公司)。

1.3 動物

來源于黑龍江中醫藥大學實驗動物中心，BALB/c 小鼠，100只，雌雄各50只，體質量20 g左右，證書號為 P00102014；英國種豚鼠，10只，雌雄各5只，體質量200 g左右，證書號為P00112014。

2 方法

2.1 ASPS對單核吞噬細胞影響

BALB/c小鼠60只，采用隨機方法分為6組。分別記為空白組、模型組、陽性藥組、ASPS低劑量組[36.25 mg/(kg·d)]、中劑量組[72.5 mg/(kg·d)]、高劑量組[145 mg/(kg·d)]。陽性藥組注射胸腺五肽[10 mg/(kg·d)]；多糖組連續7 d，每日灌胃給藥1次；除空白組外，在試驗第 5、6、7 天注射環磷酰胺注射液0.1 mL(80 mg/kg)[10]。最后一次給藥后24 h，將0.1 mL/10 g的稀釋印度墨水(用1%明膠稀釋4倍)注入尾靜脈。注入墨水2 min和6 min后，從眼靜脈叢中抽取20 μL血液，立即將其加入含有2 mL 0.1% 碳酸鈉的試管中。空白對照樣為0.1% Na2CO3溶液，在600 nm下測定光密度值。稱重小鼠脾臟及胸腺，計算廓清指數、吞噬指數和臟器指數。

2.2 ASPS對溶血素抗體生成影響

參考文獻[11]方法。BALB/c小鼠40只，隨機分為4組。分別記為空白組、ASPS低劑量組[36.25 mg/(kg·d)]、中劑量組[72.5 mg/(kg·d)]、高劑量[145 mg/(kg·d)]。對照組小鼠每天采用0.1 mL/10 g，0.9%NaCl溶液灌胃1次，多糖組每日灌胃多糖1次，持續14 d。在給藥8 d后，連續7 d經腹腔注射0.2 mL綿羊紅細胞混懸液誘發免疫反應。最后一次給藥40 min后，眼底取血，離心5 min。將血清與生理鹽水按1:300比例稀釋，取稀釋血清1.0 mL，同一試管中加入綿羊紅細胞0.5 mL，再加入10%豚鼠血清1.0 mL。37 ℃溫育10 min，冰水浴終止反應，離心。在540 nm處分別測定1.0 mL上清液與3.0 mL都氏液混合溶液的OD值，0.25 mL綿羊紅細胞與3.75 mL都氏液混合溶液的OD值。

2.3 統計學處理

3 結果

3.1 ASPS對小鼠免疫器官指數、單核-巨噬細胞功能的影響

模型組小鼠的胸腺指數、脾臟指數、廓清指數和吞噬指數與空白組之間差異顯著(P<0.01)，提示造模成功。陽性藥組和ASPS高劑量組的胸腺指數、脾臟指數、α值與模型組比較都顯著性增加(P<0.01)，具有統計學意義。ASPS中劑量組的胸腺指數、脾臟指數、α值與模型組相比只有胸腺指數顯著性升高(P<0.01)，其余均無統計學意義。ASPS低劑量組的胸腺指數、脾臟指數、α值與模型組比較均無統計學意義(P>0.05)。因此可推論ASPS能增強免疫抑制小鼠的吞噬功能。結果見表1。

表1 ASPS對小鼠免疫器官指數、單核-巨噬細胞功能的影響

3.2 ASPS對正常小鼠溶血素抗體生成的HC50的影響

在小鼠產生溶血素抗體的實驗中，與空白組相比刺五加多糖給藥組的HC50均有升高，其中高劑量組與空白組比較有統計學意義(P<0.01)，中、低劑量組相較于對照組組間比較無明顯差異(P>0.05)。因此推斷，ASPS可以促進綿羊紅細胞誘導的溶血素產生并增強免疫力。結果見表2。

表2 ASPS對正常小鼠溶血素抗體生成的HC50的影響

4 討論

本研究以BALB/c系小鼠為實驗動物，為了研究 ASPS對免疫抑制小鼠血清細胞因子的影響，使用了碳粒廓清法，并進行了ASPS對溶血素抗體生成影響實驗，進一步證實了刺五加多糖對增強免疫力的作用。

免疫是一種保護性的生理反應，為了維持機體內環境的穩態和平衡而對外來異物進行識別和排除[12-14]。免疫調節主要依靠免疫系統進行，免疫系統由免疫細胞(T、B淋巴細胞、吞噬細胞等)、免疫器官(胸腺、脾臟等)、免疫分子(淋巴因子、溶菌素等)組成。巨噬細胞來源于單核細胞，是一種多功能效應細胞，單核吞噬細胞分布于全身各器官中，當外來抗原性異物進入機體后，吞噬細胞對其進行識別、處理并將其呈遞給T細胞，刺激T細胞增殖分化，引起進一步的免疫反應。因此，吞噬細胞作為體液免疫的第一關卡，其吞噬機能可作為反應機體非特異性免疫功能的重要指標之一。

免疫細胞可分為多種，其中最主要的就是T、B淋巴細胞和吞噬細胞，在免疫反應中擔當著重要的角色。T細胞在胸腺分化成熟，B細胞在骨髓中分化成熟，兩者都聚積于脾臟，所以一旦發生免疫反應胸腺指數、脾臟指數都會發生相應變化，能夠直觀地反映機體的免疫反應。本實驗對胸腺、脾臟指系數和碳粒廓清指數進行觀測，結果表明刺五加多糖ASPS可以顯著提高免疫抑制小鼠單核巨噬細胞的吞噬能力。

小鼠中的溶血素水平是特異性免疫力的重要指標。為加強特異性抗SRBC抗體的產生，將紅細胞作為一種強抗原異物注入小鼠體內，抗體生成并釋放到外周血中，來進行溶血素檢測。在有補體參與的情況下，發生細胞免疫后的小鼠血清與綿羊紅細胞共同溫育會產生溶血反應，釋放出血紅蛋白，血清中的抗體含量與紅細胞的溶血程度有關，溶血程度可以通過顏色來判斷。因此，B細胞增殖分化的能力與補體結合分泌溶血素的能力可以通過溶血素數值來表達，從而可以反映出機體的體液免疫能力[15]。本實驗通過綿羊紅細胞致使小鼠產生溶血素抗體，對口服ASPS后抗體的變化進行了相應研究。由此可知,ASPS可以提高正常小鼠溶血素HC50，具有增強小鼠體液免疫的功能。