涼血通瘀方改善腦出血大鼠行為學評分、抗炎作用的研究

黃天馬，李建香，顧恒，過偉峰*

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046；2.南京中醫(yī)藥大學附屬南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210022)

腦出血屬于中風范疇，占我國所有卒中發(fā)病率的10%～30%，急性期病死率、致殘率高，血腫形成后易繼發(fā)二次腦損害。臨床主要使用脫水、降顱壓及手術治療等治療，但效果均未達到預期[1]。國醫(yī)大師周仲瑛認為,瘀血阻于腦絡，腦絡不通致蒙蔽清竅、火邪迫血妄行，灼傷腦絡，絡破而血溢出脈外，兩者合而為病，基于此創(chuàng)制了涼血通瘀方治療急性腦出血，以通腑瀉熱、涼血散瘀為治療方法。通腑瀉熱法體現(xiàn)了中醫(yī)學“上病下取”“腦病治腸”的理念[2]。

顱內(nèi)血腫形成后，炎癥反應貫穿了腦出血發(fā)展的所有階段[3]。本實驗采用涼血通瘀方干預腦出血大鼠模型，從行為學評分的改變、涼血通瘀方對炎性因子TNF-α、IL-1β及NF-κB通路的影響，探討涼血通瘀方的抗炎作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，體質(zhì)量200～250 g，由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物合格證號:SCXK(浙)20140001。飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，5只/籠，12 h/12 h光暗交替，恒溫恒濕。適用性飼養(yǎng)1周，自由飲水攝食。本實驗方案由南京中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會審核(201805A026)通過。

1.2 藥物

涼血通瘀方：大黃10 g，水牛角30 g，生地黃20 g，赤芍15 g，牡丹皮10 g和石菖蒲10 g。以上中藥材由安徽滬春堂中藥飲片有限公司一次性購入，南京中醫(yī)藥大學附屬南京中醫(yī)院制劑室煎制。常規(guī)方法水煎過濾、加水復煎過濾，合并2次濾液，濃縮至每毫升含生藥1.2 g。

1.3 主要試劑及儀器

大鼠TNF-α ELISA試劑盒、大鼠IL-1β ELISA試劑盒(南京奧青生物技術有限公司)；兔抗鼠NF-κB p65抗體(美國Cell Signaling公司)；10%水合氯醛(上海麥克林生化科技有限公司)；生物素標記的羊抗兔IgG(北京博奧森生物技術)。

腦立體定位儀(成都泰盟軟件有限公司)；注射泵控制器(保定蘭格恒流泵有限公司)；生物顯微鏡(德國Leica公司)；微量進樣器(上海光正醫(yī)療儀器有限公司)；酶標儀(美國PerkinElmer公司)。

2 方法

2.1 實驗動物建模及分組

對大鼠稱體質(zhì)量并編號，采用改良注射泵控制器注血/二次退針法[4]，制備大鼠腦出血模型；造模完成后，待大鼠蘇醒，使用Longa評分法評估大鼠，選擇1～3分的大鼠納入造模合格標準。

選取正常大鼠15只作為正常組，45只符合造模合格標準的大鼠隨機分為假手術組(開顱后僅插入進樣器但針頭不注血)、模型組、涼血通瘀組(造模完成3 h后開始灌胃用藥，給藥量為1.3 mL/100 g體質(zhì)量，每日灌胃1次，連續(xù)5日)。上述4組大鼠，每組設立用藥后24 h、72 h、120 h 3個時間點，每個時間點5只。

2.2 行為學評分

采用Longa五級評分法[5]，記錄大鼠行為學評分改變。標準見表1。

表1 Longa五級評分法行為學評分標準

2.3 ELISA法檢測腦組織TNF-α、IL-1β的表達

實驗完成后，對腦出血大鼠進行取材，將每組各時間點的大鼠腦組織進行取樣，并進行處理后保存?zhèn)溆谩Ｈz測腦組織TNF-α、IL-1β的ELISA試劑盒按照說明書進行操作。在酶標儀上測定450 nm波長處吸光度(OD值)，按照公式計算樣本濃度。

2.4 免疫組化法檢測NF-κB p65表達

將經(jīng)過處理的組織石蠟切片脫蠟水化、修復抗原后，使用山羊血清進行封閉并孵育過夜。經(jīng)DAB顯色于顯微鏡下觀察，使用蘇木素復染后脫水、中性樹膠封片。切片使用生物顯微鏡觀察，每張切片挑選5張背景光一致的200倍視野照片。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，根據(jù)公式求取平均光密度值IOD/AREA(Mean Density)。

2.5 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 行為學評分比較

統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)假手術組大鼠在所有時間點的行為學評分均為0。模型組大鼠在3個時間點均出現(xiàn)了神經(jīng)功能損害現(xiàn)象，程度不一。與假手術組比，P均<0.05。涼血通瘀組大鼠在72 h時間點行為學評分已明顯低于模型組(P<0.05)，并持續(xù)降低。見表2。

表2 各組大鼠不同時間點行為學評分比較分)

3.2 炎癥因子TNF-α、IL-1β的ELISA測定結果比較

相比于假手術組，模型組腦組織TNF-α在3個時間點均升高(P<0.01)；相比于模型組，涼血通瘀組腦組織TNF-α在3個時間點均降低(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠在不同時間點腦組織TNF-α水平比較

在全部3個時間點，模型組腦組織IL-1β均明顯高于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組在3個時間點均明顯低于模型組(P<0.01)。見表4。

表4 各組大鼠在不同時間點腦組織IL-1β水平比較

3.3 免疫組化測定NF-κB p65結果比較

在24 h時間點，模型組大鼠NF-κB p65明顯高于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組高于假手術組(P<0.05)，低于模型組(P<0.05)；在72 h時間點，模型組顯著高于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組與假手術組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，低于模型組(P<0.01)；在120 h時間點，模型組顯著高于假手術組(P<0.01)，涼血通瘀組與假手術組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，低于模型組(P<0.01)。見表5。

表5 各組大鼠在不同時間點NF-κB p65水平比較

4 討論

在腦出血的發(fā)生及病情發(fā)展變化中，炎性反應可貫穿于腦出血整個病理過程的各個階段。腦出血發(fā)生后，可引起多種細胞因子的分泌，而其中某些因子被證實為生物標志物，如核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB、白介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等[6]。這些因子可以直接或者間接的參與到腦出血后病理過程的炎癥反應中，近年來成為研究熱點之一。

作為NF-κB家族重要成員之一的p65受到刺激后活化，進入細胞核，誘導眾多細胞因子的表達[7]，不斷促進炎癥的發(fā)生發(fā)展。在大量分泌的細胞因子如TNF-α、IL-1β的刺激下，巨噬細胞、星形膠質(zhì)細胞被持續(xù)激活，從而導致了血腦屏障通透性的破壞，再次加重腦水腫，腦的繼發(fā)性損害不斷持續(xù)上升。炎性反應在腦損害-神經(jīng)功能受損-繼發(fā)性腦損害的惡性循環(huán)中級聯(lián)放大[8]。

腦出血發(fā)生以后，NF-κB通路的活化、刺激TNF-α、IL-1β的大量分泌是繼發(fā)性腦損害的罪魁禍首之一。如何降低、防治腦出血后的繼發(fā)性腦損害成為了近年來國內(nèi)外的研究熱點，而中醫(yī)藥治療腦出血在臨床實踐中取得了良好的療效，通過中醫(yī)藥治療是否可調(diào)控NF-κB的活化，成為了新的研究思路與方法。

本實驗選取了國醫(yī)大師周仲瑛所創(chuàng)的涼血通瘀方，使用該方干預腦出血大鼠模型，選取行為學評分作為腦神經(jīng)功能損害指標，并測定腦組織中NF-κB、TNF-α、IL-1β的表達，從炎癥的發(fā)生發(fā)展機制探尋涼血通瘀方在腦出血大鼠模型中的抗炎作用。實驗結果揭示了使用涼血通瘀方24 h后，持續(xù)降低NF-κB p65的表達，NF-κB通路活性降低，TNF-α、IL-1β的含量顯著低于模型組，證實了涼血通瘀方通過抑制NF-KκB通路的活化，降低TNF-α、IL-1β等炎性因子的分泌，減少損害性炎癥發(fā)生，改善了腦出血大鼠的神經(jīng)功能缺損，發(fā)揮了抗炎作用。

綜上所述，涼血通瘀方能夠調(diào)控腦出血大鼠NF-κB通路活化、抑制炎性因子的分泌，從而減輕炎癥反應的發(fā)生、降低炎癥的級聯(lián)放大效應，改善了腦出血大鼠的行為學評分，發(fā)揮抗炎作用。本實驗依托于名老中醫(yī)的有效驗方，結合當前新的研究思路與方法，為本方的作用機制提出了新的科學解釋。