腫瘤標(biāo)志物TTF-1預(yù)測肺腺癌EGFR突變模型的構(gòu)建及初步評估

楊燕君， 張曉麗， 董躍華， 姜偉華， 王貴剛， 魏玉磊， 周 義， 高永山

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸心外科， 河北 張家口 075000)

近年來，肺癌發(fā)病率、死亡率均明顯升高，是嚴(yán)重威脅人類健康的惡性腫瘤之一，主要包括非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌兩種類型。肺腺癌屬于非小細(xì)胞肺癌，早期癥狀一般不明顯，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)晚期，臨床病死率較高。目前，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)等靶向藥物已成為晚期肺腺癌患者治療的重要方式之一，尤其是針對有表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)基因突變的患者[1]。研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變的肺腺癌患者接受EGFR-TKIs靶向治療后，可明顯降低死亡風(fēng)險，改善患者生存質(zhì)量[2]。但由于EGFR基因檢測對組織標(biāo)本、實驗設(shè)備等要求較高，且檢測費(fèi)用昂貴，接受EGFR基因突變檢測患者較少，導(dǎo)致基于腫瘤驅(qū)動基因突變的靶向治療難以實施。因此，尋找能夠有效、準(zhǔn)確預(yù)測肺腺癌患者EGFR基因突變的腫瘤標(biāo)志物，對指導(dǎo)患者靶向治療具有重要臨床意義。甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1(thyroid transcription factor-1，TTF-1)常表達(dá)于肺和甲狀腺組織中，其異常表達(dá)傳統(tǒng)用于肺腺癌病理分型[3]，而與患者EGFR基因突變關(guān)系研究相對較少。鑒于此，本研究通過分析不同EGFR基因表型肺腺癌組織TTF-1表達(dá)差異，并探討肺腺癌組織TTF-1表達(dá)聯(lián)合其他因素對患者EGFR基因突變的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2018年6月至2019年5月本院胸心外科收治的120例初治肺腺癌患者作為受試對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為肺腺癌；②組織標(biāo)本來源于經(jīng)皮穿刺或經(jīng)纖維支氣管鏡肺活檢；③均接受EGFR基因表型檢測；④臨床資料詳細(xì)完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)灶位于肺外；②入組前未接受任何抗腫瘤治療；③治療期間患者依從性差；④伴有嚴(yán)重心、肝、腎等疾病者；⑤女性哺乳期。根據(jù)EGFR基因表型檢測結(jié)果將120例患者分為EGFR基因野生(非突變)組72例、EGFR基因突變組48例。EGFR基因野生組有男性39例、女性33例，年齡25～65歲、平均年齡(47.39±9.27)歲，有吸煙史(連續(xù)或累計吸煙≥6個月)35例、無吸煙史37例，功能狀態(tài)(performance status，PS)評分≤2分36例、>2分36例，腫瘤位置：左肺32例、右肺40例，TNM分期：Ⅲ期45例、Ⅳ期27例；EGFR基因突變組有男性12例、女性36例，年齡25～64歲、平均年齡(47.20±10.05)歲，有吸煙史(連續(xù)或累計吸煙≥6個月)10例、無吸煙史38例，PS評分≤2分31例、>2分17例，腫瘤位置：左肺18例、右肺30例，TNM分期：Ⅲ期19例、Ⅳ期29例。本研究方案符合本院倫理委員會要求，且患者均自愿簽署知情同意書。

1.2TTF-1表達(dá)檢測:所有組織標(biāo)本均用10%甲醛溶液固定，脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片(厚4μm)，使用小鼠抗人TTF-1單克隆抗體試劑(購自上海冠導(dǎo)生物工程有限公司)，以En Vision免疫組化法檢測TTF-1表達(dá)，操作步驟參照試劑盒說明書。結(jié)果判定：TTF-1染色定位于細(xì)胞核，陰性(-)：無陽性細(xì)胞染色，弱陽性(+)：陽性細(xì)胞染色≤10%，中陽性(++)：10%<陽性細(xì)胞染色≤50%，強(qiáng)陽性(+++)：陽性細(xì)胞染色>50%。

1.3EGFR基因表型檢測:使用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)法進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增，主要檢測EGFR基因外顯子18、19、20、21突變。人EGFR基因突變檢測試劑盒購自北京雅康博生物科技有限公司，具體步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果判定：樣品外控信號擴(kuò)增曲線Ct值≥26提示為野生型，<26則提示為突變型。

2 結(jié) 果

2.1不同EGFR基因表型肺腺癌患者TTF-1表達(dá)陽性率比較:TTF-1定位于細(xì)胞核，以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或褐色顆粒為陽性表達(dá)(圖1)。檢測結(jié)果顯示，EGFR基因突變組肺腺癌患者TTF-1表達(dá)陽性率顯著高于EGFR基因野生組患者(P<0.05)，見表1。

表1 不同EGFR基因表型肺腺癌患者TTF-1表達(dá)陽性率比較n(%)

圖1 免疫組化染色細(xì)胞核中TTF-1表達(dá)(En Vision免疫組化法×200)

2.2EGFR基因突變情況與肺腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系:EGFR基因突變情況與肺腺癌患者年齡、PS評分及腫瘤位置均無關(guān)(P>0.05)，與肺腺癌患者性別、吸煙史及TNM分期均有關(guān)(P<0.05)，見表2。

2.3影響肺腺癌患者EGFR基因突變的多因素Logistic回歸分析:以肺腺癌患者是否發(fā)生EGFR基因突變?yōu)橐蜃兞浚孕詣e、吸煙史、TNM分期、TTF-1表達(dá)為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)TNM分期、TTF-1表達(dá)是肺腺癌患者發(fā)生EGFR基因突變的獨立危險因素(P<0.05)，而性別、吸煙史與肺腺癌患者EGFR基因突變發(fā)生無獨立相關(guān)性(P>0.05)，見表3。

表2 EGFR基因突變情況與肺腺癌患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系n(%)

表3 影響肺腺癌患者EGFR基因突變的多因素Logistic回歸分析

表4 TTF-1表達(dá)單獨及其與臨床病理參數(shù)聯(lián)合對肺腺癌患者EGFR基因突變檢查結(jié)果

2.4TTF-1表達(dá)單獨及其與臨床病理參數(shù)聯(lián)合對肺腺癌患者EGFR基因突變的預(yù)測價值:以TTF-1、性別、吸煙、TNM分期作為變量構(gòu)建肺腺癌患者EGFR突變分析的預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)TTF-1、性別、吸煙、TNM分期四者聯(lián)合預(yù)測肺腺癌患者發(fā)生EGFR基因突變的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均最高，其次為TTF-1、性別、吸煙三者聯(lián)合預(yù)測，再次為TTF-1聯(lián)合性別預(yù)測，TTF-1表達(dá)單獨預(yù)測靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值均最低，見表4、表5。

表5 TTF-1表達(dá)單獨及其與臨床病理參數(shù)聯(lián)合對肺腺癌患者EGFR基因突變的預(yù)測價值(%)

3 討 論

肺腺癌是腺上皮惡性腫瘤，大約占肺原發(fā)腫瘤的40%，早期無特殊癥狀，發(fā)展至晚期時病情較嚴(yán)重，需及時對癥治療。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，以腫瘤驅(qū)動基因為靶點的靶向治療可明顯延長患者生存期，已成為當(dāng)前晚期肺腺癌個體化治療的新方向[4]。研究發(fā)現(xiàn)伴有EGFR基因突變的肺腺癌患者才能從EGFR-TKIs靶向治療獲益，因此接受EGFR-TKIs靶向治療前必須檢測患者EGFR基因突變情況[5]。目前，臨床檢測EGFR基因方法多樣，但檢測技術(shù)要求均較高，且因費(fèi)時、費(fèi)用高而難以普及開展。因此，尋找可靠有效的腫瘤標(biāo)志物用于預(yù)測肺腺癌患者EGFR基因突變情況至關(guān)重要，以期為臨床使用EGFR-TKIs靶向治療肺腺癌提供幫助。

TTF-1又稱為NKX同源框-1(NKX2-1)，屬于NKX2轉(zhuǎn)錄基因家族，位于人染色體14q13.3，生理狀態(tài)下主要分布于甲狀腺和部分大腦前腹側(cè)核，其異常表達(dá)影響甲狀腺和肺功能，在腫瘤形成、發(fā)展過程中起重要作用[6,7]。作為一種常見的腫瘤標(biāo)志物，TTF-1在肺腺癌診斷、治療及預(yù)后評估方面均具有非常明顯的應(yīng)用價值[8]。趙煥芬等[9]研究表明，癌組織TTF-1表達(dá)可用于肺腺癌與肺鱗癌的鑒別診斷，且與其他指標(biāo)聯(lián)合有助于提高肺腺癌診斷的靈敏度和特異性。彭昆偉等[10]研究發(fā)現(xiàn)，肺腺癌組織TTF-1陽性患者中EGFR基因突變率顯著高于陰性患者，臨床可根據(jù)TTF-1表達(dá)情況篩選EGFR基因突變高危患者。此外，丁重陽等[11]研究報道，EGFR基因突變在女性、不吸煙及TTF-1表達(dá)陽性肺腺癌患者中較高，且多因素Logistic回歸分析顯示TTF-1陽性是EGFR基因突變的獨立影響因子。綜上發(fā)現(xiàn)，本研究探討腫瘤標(biāo)志物TTF-1預(yù)測肺腺癌EGFR突變模型的構(gòu)建及初步評估具有一定臨床意義。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGFR基因突變組肺腺癌患者TTF-1表達(dá)陽性率遠(yuǎn)高于EGFR基因野生組患者，與彭昆偉等[10]研究結(jié)果基本一致，提示肺腺癌組織TTF-1表達(dá)陽性患者可能更易發(fā)生EGFR基因突變；且研究發(fā)現(xiàn)EGFR基因突變狀態(tài)還與肺腺癌患者性別、吸煙史及TNM分期有關(guān)，提示臨床使用TTF-1表達(dá)預(yù)測肺腺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)時，可同時將患者性別、吸煙史及TNM分期結(jié)合起來考慮，可能更有助于預(yù)測肺腺癌EGFR基因突變情況。多因素Logistic回歸分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNM分期、TTF-1表達(dá)是肺腺癌患者發(fā)生EGFR基因突變的獨立危險因素，與丁重陽等[11]研究結(jié)果類似，進(jìn)一步提示分析肺腺癌患者TNM分期和TTF-1表達(dá)可能對預(yù)測EGFR基因突變狀態(tài)具有重大作用。本研究將TTF-1、性別、吸煙、TNM分期作為變量構(gòu)建肺腺癌患者EGFR突變分析的預(yù)測模型，發(fā)現(xiàn)預(yù)測靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度、陽性預(yù)測值及陰性預(yù)測值高低依次為：TTF-1、性別、吸煙、TNM分期四者聯(lián)合預(yù)測，TTF-1、性別、吸煙三者聯(lián)合預(yù)測，TTF-1聯(lián)合性別預(yù)測，TTF-1表達(dá)單獨預(yù)測，提示多個因素構(gòu)建的預(yù)測模型可提高對肺腺癌患者EGFR基因突變的預(yù)測能力。

綜上所述，肺腺癌患者TTF-1陽性提示EGFR基因突變，TTF-1聯(lián)合性別、吸煙、TNM分期對肺腺癌患者EGFR基因突變狀態(tài)預(yù)測價值最高，檢測TTF-1表達(dá)可為肺腺癌患者EGFR-TKIs靶向治療提供一定參考。本研究預(yù)測肺腺癌EGFR突變模型的構(gòu)建納入變量較少，應(yīng)擴(kuò)大樣本量繼續(xù)進(jìn)行研究。