顱腦損傷患兒血清中miR-34a和NO TNF-α表達及意義

汪生毅， 孫小紅， 王新法

(1.青海省婦女兒童醫院腦外科， 青海 西寧 810000 2.江蘇省南京市兒童醫院神經外科， 江蘇 南京 210000)

顱腦損傷(traumatic brain injury，TBI)是指直接或間接暴力造成的腦損傷，TBI患兒還可伴有腦腫脹和進行性顱內壓升高，具有較高的致死率和致殘率，嚴重威脅患兒身心健康[1]。探究TBI患兒病情監測指標并分析其臨床價值對TBI患兒的診治具有重要意義。微小RNA-34a(microRNA-34a，miR-34a)是miR-34家族成員，研究發現，miR-34a在抑制細胞增殖、促進細胞凋亡方面有很大作用[2,3]。一氧化氮(Nitric Oxide，NO)是血管內皮細胞分泌的新型生物信使分子，在心腦血管、神經調節等方面發揮重要作用[4]。腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)是重要的免疫應答及炎癥反應調節因子，在腦部炎癥活動及免疫中有重要作用[5]。目前miR-34a、NO、TNF-α在TBI患兒中的研究較少。本研究通過檢測TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α表達水平，探討三者聯合檢測在TBI中的意義，以期為臨床診治TBI提供一定參考。

1 資料與方法

1.1一般資料:選取2017年9月至2019年8月青海省婦女兒童醫院收治的78例TBI患兒為TBI組，其中男性40例、女性38例，年齡2～14歲，平均年齡(8.36±2.72)歲。根據GCS評分[6]將TBI患兒分為輕度組23例(≥11分)，中度組30例(6～10分)，重度組25例(3～5分)。GCS評分最高分為15分，評分越低，患兒腦顱損傷越嚴重。納入標準：①受傷后12h內入院接受治療；②入院后經CT等影像學檢查確診為TBI；③年齡在2歲-14歲之間。排除標準：①出現深度昏迷者；②合并惡性腫瘤者；③合并慢性疾病或感染性疾病者；④合并心、肝、腎功能不全者。同時選取同期體檢健康的兒童80例為對照組，其中男性41例、女性39例，年齡3～14歲，平均年齡(8.93±3.12)歲。兩組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)。本研究經青海省婦女兒童醫院倫理委員會批準通過，均取得受試兒童的家屬知情同意并簽字。

1.2主要試劑與儀器:miRcute miRNA提取分離試劑盒、miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒、Talent熒光定量檢測試劑盒(北京天根生化有限公司，批號DP501、KR201、FP401)；TNF-α酶聯免疫吸附(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，批號ml077385)；NO測試盒(化學法)(南京建成生物工程研究所，批號A013-1)；無水乙醇、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)(上海生物工程有限公司，批號SL-0917、SD-1668)；紫外分光光度計(美國Merin-ton公司，型號NanoDrop2000)；實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司，型號7500Fat)；酶標儀(美國Bio-Rad公司，型號MODEL550)。

1.3方 法

1.3.1樣品采集及保存:所有病例均于入院后1h內、對照組于體檢當日清晨空腹抽取外周靜脈血5mL，均靜置30min，室溫3000rpm/min，離心15min，吸取上清液分別裝入EP管中，置于-80℃冰箱中保存備用。

1.3.2實時熒光定量PCR法檢測血清中miR-34a水平:使用miRcute miRNA提取分離試劑盒提取血清RNA，檢測其濃度與純度。使用miRcute miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒進行逆轉錄反應得到cDNA，反應體系為20μL(0.5g/mL總RNA 1μL，反轉錄酶2μL，RNase Free水5μL，2×反轉錄緩沖混合物10μL，0.1% BSA 2μL)，反應條件為：37℃，60min；85℃，5min；4℃，5min。采用Talent熒光定量檢測試劑盒和7500Fat型實時熒光定量PCR儀對兩組研究對象血清中miR-155水平進行定量檢測，反應體系為20μL(cDNA模板 2μL，2×miRcute miRNA Premix 10μL，正向引物0.4μL，正向引物0.4μL，ddH2O 7.2μL)，引物交由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列詳見表1，反應條件為：94℃ 2min；95℃ 20s，60℃ 34s，45個循環。溶解曲線分析為95℃ 15s，60℃ 1min，95℃ 15s (收集熒光信號)，60℃ 15min。使用U6為內參基因，相對表達水平RQ=2-△△Ct(△Ct = Ct目標-Ct內參，△△Ct =△Ct實驗組-△Ct對照組)。

表1 引物名稱及序列

1.3.3化學比色法檢測血清中NO水平:采用化學比色法檢測各組研究對象血清中NO的水平，檢測步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.4ELISA法檢測血清中TNF-α水平:采用ELISA法檢測各組研究對象血清中TNF-α的水平，檢測步驟嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.4隨訪:對所有的患兒進行復查或電話隨訪，隨訪時間為3個月，末次隨訪時間截止2019年11月30日，死亡患兒以死亡時間作為隨訪截止期，無失訪。觀察記錄患兒隨訪期間生存情況。

2 結 果

2.1對照組與TBI組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平比較:TBI組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平均高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 對照組與TBI組患兒血清中miR-34a NO TNF-α水平比較

2.2不同程度TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平及GCS評分比較:重度組TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平均高于中度組與輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)；中度組TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平均高于輕度組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 對照組與TBI組患兒血清中miR-34a NO TNF-α水平及GCS評分比較

2.3TBI患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平與GCS評分相關性分析:經Pearson法分析得，TBI患兒血清miR-34a、NO、TNF-α水平與GCS評分均呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 TBI患兒血清中miR-34a NO TNF-α水平與GCS評分相關性

2.4ROC曲線分析血清中miR-34a、NO、TNF-α水平對TBI的預測價值:ROC曲線分析結果顯示，血清miR-34a、NO、TNF-α水平預測TBI的曲線下面積分別為0.821(95%CI：0.675～0.967)、0.902(95%CI：0.816～0.989)、0.851(95%CI：0.741～0.961)，截斷值為0.65、38.45μmoL/L、153.49pg/mL，敏感度為88.9%、94.4%、72.2%，特異度72.0%、70.0%、98.0%。聯合檢測預測TBI的曲線下面積為0.998(95%CI：0.992～1.000)，敏感度為100.0%，特異度98.0%。見圖1。

2.5血清中miR-34a、NO、TNF-α水平與TBI患兒3個月存活率的關系:死亡組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平明顯高于存活組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表5。

表5 血清中miR-34a NO TNF-α水平與TBI患兒3個月存活率的關系

圖1 ROC曲線分析血清中miR-34a、NO、TNF-α水平對TBI的預測價值

3 討 論

TBI可對患兒腦神經功能造成不同程度的損害，其主要臨床癥狀為頭痛、嘔吐、凝血功能障礙、意識障礙、瞳孔散大、生命體征紊亂等，嚴重影響了患兒的身心健康及生活質量[7]。重度TBI患兒死亡率高、預后差，對機體多臟器功能均有一定的影響，尋找監測TBI的病情進展及預后的生物指標是十分有必要的[8]。MicroRNA參與多種疾病的發生，可作為診斷多種心、腦疾病的重要標志物[9]。Tolosa[10]等研究發現，在使用體內或體外方法實驗性誘導TBI后，miR-34a上調表達。本研究結果顯示TBI組患兒血清中miR-34a水平高于對照組，重度組TBI患兒血清中miR-34a水平高于中度組與輕度組，中度組TBI患兒血清中miR-34a水平高于輕度組，提示miR-34a在TBI患兒血清中呈高表達，可能與TBI的發生、發展有關。

NO能介導炎性反應進而加重細胞損傷，在正常水平下可引起血管擴張，促進血液循環，但其水平過高卻會加重對神經細胞的毒害作用[11]。呂學文[12]等研究發現，與對照組相比，NO水平在輕度組、中度組及重度組創傷性TBI患者血清中依次升高。本研究結果顯示，TBI組患兒血清NO水平高于對照組，重度組患兒血清中NO水平高于中度組與輕度組，中度組患兒血清中NO水平高于輕度組，提示NO水平與TBI嚴重程度密切相關，與呂學文等研究結果一致。TNF-α是由巨噬細胞和單核細胞產生的細胞因子，具有廣泛的生物學效應，可特異性殺傷腫瘤細胞，參與炎癥反應及免疫反應，有研究發現TNF-α水平升高與TBI程度及預后有關[13,14]。王娜[15]等研究發現，TBI患者TNF-α水平均高于對照組，且中、重度組患者TNF-α水平均高于輕度組，重度組患者TNF-α水平均高于中度組。本研究結果顯示，TBI組患兒血清中TNF-α水平高于對照組，且TNF-α水平在輕度組、中度組、重度組TBI組患兒血清中依次升高，提示TNF-α可能與TBI的發生、發展有關。本研究進一步分析發現，TBI患兒血清miR-34a、NO、TNF-α水平與GCS評分均呈負相關，提示miR-34a、NO、TNF-α水平與TBI患兒的病情程度有明顯相關性，三者可能存在協同作用參與TBI病程中，但其具體機制有待進一步探究。ROC分析顯示，miR-34a、NO、TNF-α均能較好的預測TBI患兒，聯合檢測預測效能更高，提示三者可能作為臨床預測TBI的生物指標。另外本研究結果顯示死亡組患兒血清中miR-34a、NO、TNF-α水平明顯高于存活組，提示miR-34a、NO、TNF-α水平有助于評估TBI患兒不良預后，可作為反映TBI患兒不良預后的重要生物學標志物。

綜上所述，miR-34a、NO、TNF-α在TBI患兒血清中均呈高表達水平，與TBI程度密切相關，具有一定預測價值，可作為反映TBI患兒不良預后的重要生物學標志物。但是由于樣本數量不多，尚有不足之處，今后將重視擴大樣本數量進行深入研究。