納米N-TiO2對口腔科環境消毒效果及抗菌機理的初探*

化萌萌 唐曉君 王亞宇 盧怡 董作青

醫療場所環境中的微生物污染問題，一直以來都對于醫護人員及患者的人身健康存在重大威脅［1］。目前，醫院根據環境等級分類進行消毒工作，以防止交叉感染造成的嚴重后果。臨床上常見的消毒手段包括消毒劑（含氯消毒劑、2%戊二醛等)［2，3］，紫外線殺菌［4］，動態空氣凈化器［5］等。雖然這些消毒手段可對微生物起到殺滅作用，但是存在作用時間短、對人體有傷害［6］等問題。因此需要一種能夠安全長效發揮抗菌作用的抗菌劑。

納米TiO2以其光催化活性高及強氧化分解能力等特點而受到關注［7，8］。研究表明，在口腔種植體表面加入改性納米TiO2涂層后，對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的殺菌率可達95.29%，具有良好的抗菌效果［9，10］。然而，納米TiO2也存在一定的局限性。由于其禁帶寬度較大，需要紫外光輔助才能完成反應。為此，本研究團隊前期［11］使用氮摻雜技術，完成了高可見活性納米N-TiO2噴劑的規模化制備及應用，其在室內自然光下就能直接將光能轉化為化學能。并研究了其對醫療環境中物體表面的常見病菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念菌株的抗菌性能檢測，已證實具有良好的滅菌效果［12］。現將納米N-TiO2噴劑用于口腔科臨床環境中，并與臨床上常用消毒劑健之素進行對比，以期研究其在實際臨床情況下的抗菌性能，并對其抗菌機理進行初探。

1.研究對象與方法

1.1 研究對象 北京市某三甲醫院口腔科診室中選取牙片室、消毒室和打磨室三種診室作為實驗場所，室內溫度控制在22～26℃，濕度50%～65%。每間診室工作人員1名，工作時間嚴格限制其他人員出入。

1.2 實驗材料及設備 納米N-TiO2噴劑（分散劑有效含量為6%、粘度為2mpa·s，質量分數1wt%，平均粒徑＜65nm，相對密度3.8-3.9g/cm2，pH=7-8；北京科技大學提供)；0.9%無菌生理鹽水；健之素消毒劑（其主要成份為三氯異氰脲酸鈉速溶泡騰制劑，每片含有效物250mg，北京長江脈醫藥科技有限責任公司）。

熒光燈（D50），色溫5000K，顯色指數大于90%，波長分布在400～780nm。

1.3 實驗分組在每個場所選取15個大小約10cm×10cm的物表，隨機分為實驗組（使用納米N-TiO2進行噴涂，5個），陽性對照組（使用健之素消毒劑進行噴涂，5個）；陰性對照組（使用0.9%無菌生理鹽水進行噴涂，5個）。

1.4 實驗菌株和培養基 大腸埃希氏菌（CGMCC 1.3373)，培養基為LB培養基

1.5 方法

1.5.1 納米N-TiO2噴劑消毒效果的檢測

(1）采樣按照《醫院消毒衛生標準》(GB 15982-2012）對實驗物表進行采樣。采樣方法：用5cm×5cm的標準滅菌規格板，放在被檢物體表面，用沾有無菌生理鹽水的無菌棉拭子在規格板內均勻涂擦10次轉動采樣，將被污染部分剪下，其余投入2mL滅菌生理鹽水試管中立即送檢，并進行菌落計數（CFU/cm2)。

采樣時機：選取下午5點口腔科診療結束后，采樣前，關閉門、窗，在無人走動的情況下，靜止10min后進行采樣。實驗組和對照組均連續取樣5天。

(2）消毒方法模擬室內自然光照：打開熒光燈（D50），穩定0.5h以上，然后調節熒光燈高度或功率來調節光照強度，采樣照度計測量，記錄測量用光照強度（1000～1500lx），偏差不超過2%。

首先對實驗物表進行物理清潔，然后通過噴涂工藝（壓力0.7MPa，噴槍口徑0.5mm，噴涂時間15s）進行物表消毒。其中，實驗組用納米N-TiO2噴劑進行噴涂消毒，陽性對照組使用健之素進行噴涂消毒，陰性對照組使用0.9%無菌生理鹽水進行噴涂。各組噴涂消毒時間5min。按照上述采樣方法進行細菌培養與計數。

為避免研究的偏倚，本研究的所有操作和實驗處理均由經過培訓的同一個人完成。

(3）評價標準按照《消毒技術規范》［13］的要求，口腔科環境分類為Ⅳ類環境，要求消毒后環境細菌總數≤10.0 CFU/cm2。

(4）統計學分析用SPSS軟件22.0版本進行統計學分析，采用χ2檢驗。P＜0.05認為差異有統計學意義。

1.5.2 納米N-TiO2噴劑抗菌機理的初步觀察

為了研究抗菌噴劑的抗菌機理，在100mL濃度為106cfu/mL的大腸桿菌中加入0.1g納米N-TiO2噴劑，然后進行自然光照。在不同光照時間下取出一定量的菌液，進行乙醇脫水，制備樣品進行掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM)，通過觀察大腸桿菌的形貌來研究其殺滅過程。

2.結果

2.1 納米N-TiO2噴劑消毒效果的檢測

2.2.1 三種方法對實驗物表消毒前后的細菌菌落數結果比較（表1，2）在進行消毒前，口腔科各診室物表存在污染，細菌菌落數均值分別為牙片室279±11.6(CFU/cm2)，消 毒 室197±10.3(CFU/cm2)，打磨室268±12.1(CFU/cm2)；實驗組（納米N-TiO2組）在消毒后各診室實驗物表的細菌菌落數均值分別為3±1.3(CFU/cm2)，3±0.9(CFU/cm2)，4±0.7(CFU/cm2)，殺菌率為100%，與消毒前差異有明顯統計學意義（P＜0.01)；陽性對照組（健之素組）在消毒后各診室實驗物表的細菌菌落數均值分別為36±4.7(CFU/cm2)，24±1.3(CFU/cm2)，39±3.2(CFU/cm2)，殺菌率為88.7%，與消毒前差異有明顯統計學意義（P＜0.01)；陰性對照組（0.9%無菌生理鹽水）各診室的實驗物表細菌菌落數 均 值分 別為267±11.8(CFU/cm2)，189±11.7(CFU/cm2)，269±10.0(CFU/cm2)，與消毒前物表菌落數無明顯差異（P＞0.05)。

表1 三種方法噴涂后口腔各診室物表的細菌菌落數（X±S）

表2 口腔各診室物表噴涂納米N-TiO2前后的細菌菌落數（±S)

表2 口腔各診室物表噴涂納米N-TiO2前后的細菌菌落數（±S)

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2.1.2 納米N-TiO2噴劑對實驗物表消毒后其表面細菌菌落數的日間變化（表2）口腔科各診室實驗物體表面噴涂納米N-TiO2后，其表面細菌菌落數均數的日間差異不顯著，P＞0.05。

2.2 納米N-TiO2噴劑抗菌機理的初步觀察

2.2.1 大腸桿菌在使用N-TiO2噴劑殺菌過程中的SEM觀察 圖1為未經處理的大腸桿菌原始形貌，可知，未經處理的大腸桿菌菌體呈兩端鈍圓的直桿狀，長度在0.5-1.5μm之間。視野中的菌體結構均比較完整，飽滿無損傷。

表2 噴涂納米N-TiO2后實驗物體表面細菌菌落數值（X±S）的日間比較

在經5min光催化殺菌處理后，部分菌體的局部出現變形（圖2)；15～30min后，大部分細菌出現了不同程度的結構變形，主要體現為局部皺縮與凹陷（圖3)；60min后發現，視野中所有細菌基本都出現了較為明顯的變形，菌體表面出現了開放性的破損與孔洞，細胞外層結構被破壞，部分細菌的結構已完全崩塌（圖4)。

圖1 大腸桿菌原始形貌

圖2 光照5 min后的大腸桿菌形貌

圖3 光照15 min、30 min后大腸桿菌的形貌

圖4 光照60 min后大腸桿菌的形貌

2.2.2 大腸桿菌在使用納米N-TiO2噴劑殺菌過程中的TEM觀察 圖5(a）為未經處理的大腸桿菌透射電鏡圖，可觀察到完整、光滑的的細胞壁與細胞質膜結構，周質間隔緊密，胞漿均勻分布。經5min光催化殺菌后，部分細菌內部出現了一些淺灰色區域，如圖5(b)。15min后可見圖5(c）中淺灰色區域周圍的細胞外層細胞壁與膜結構出現了明顯的不連續區段。圖6(a)(b）為光催化處理30min與60min的部分大腸桿菌樣品，可觀察到有部分細菌的胞內物質紊亂或已完全消失。

圖5 (a）大腸桿菌原貌；(b）光照5 min后大腸桿菌形貌；(c）光照15 min后大腸桿菌形貌

圖6 (a）光照30 min后大腸桿菌形貌；(b）光照60 min后大腸桿菌形貌

3.討論

醫院感染控制一直以來都是關注的熱點問題。據WHO統計數據表明，全球60億人口中，每年大約3億人因病住院治療。其中，平均8.7%的住院病人發生了不同嚴重程度的醫院感染［14］。如何對醫院環境及物表進行有效消毒，是杜絕院內感染的重中之重。目前醫院的消毒滅菌手段主要有：物理滅菌法（壓力蒸汽滅菌、紫外線消毒、臭氧消毒等）和化學滅菌法（各種化學消毒劑：醛類、過氧化合物類、醇類消毒劑、含氯及含碘消毒劑等）兩大類［15］。但這些現有消毒手段也存在一些局限性，如消毒效果的長效性難以保持，一旦停止消毒，環境中的病原菌數量很快回升［16］。化學消毒劑在消毒過程中對設備、器械等有腐蝕性，易分解、產生二次污染。此外，有些病原菌等微生物在對抗消毒劑過程中形成生物被膜，從而阻擋或排除消毒劑分子，最終導致消毒劑失活［17］。

納米TiO2抗菌劑以其抗菌譜廣，無污染等特點近年來成為學者的研究重點。納米TiO2在光的激發下，產生電子和空穴，把光能轉化為化學能，自身不被消耗，具有長效性的特點［7，8］。國內外相關研究表明：光催化納米TiO2對革蘭陰性菌，革蘭陰性菌，絲狀菌和單細胞真菌等都有很好的殺滅效果［18］。但TiO2的禁帶寬度為3.2eV，處于紫外區，只有在紫外光下才能發揮抗菌作用。本課題組通過同步晶化與氮摻雜技術，以無機助劑為分散系成功制備出了納米N-TiO2噴劑，突破了只能利用紫外光的局限性。通過對醫院口腔科常見微生物進行調查，已證實納米N-TiO2對醫院常見致病微生物有較好的抑菌效果［12］。并已對醫院診室空氣消毒進行了初期研究［19-21］。

為進一步應用于醫院臨床實際環境中，本研究選取口腔科牙片室、消毒室和打磨室三種診室作為實驗場所，使用納米N-TiO2噴劑對實驗物表進行噴涂消毒，同時選用臨床上常用消毒劑健之素作為對照組。可知，在進行物表消毒前，口腔科各診室物表存在污染，消毒后，實驗組各診室實驗物表的細菌菌落數均值分別為3±1.3(CFU/cm2)，3±0.9(CFU/cm2)，4±0.7(CFU/cm2)，殺 菌 率 為100%，與消毒前差異有明顯統計學意義（P＜0.01)；陽性對照組各診室實驗物表的細菌菌落數均值分別為36±4.7(CFU/cm2)，24±1.3(CFU/cm2)，39±3.2(CFU/cm2)，殺菌率為88.7%；陰性對照組各診室的實驗物表細菌菌落數均值分別為267±11.8(CFU/cm2)，189±11.7(CFU/cm2)，269±10.0(CFU/cm2)。說明納米N-TiO2噴劑消毒效果優于健之素。

通過連續5天動態監測結果可知，各診室實驗物體表面噴涂納米N-TiO2后，其表面細菌菌落數均數的日間差異不顯著（P＞0.05)。在檢測次數內，口腔科實驗物表的菌落數均達到標準值（10cfu/cm2)。說明，在口腔科實際環境中納米N-TiO2噴劑具有良好的應用前景。

為了研究抗菌噴劑的抗菌機理，本研究以醫院環境中較常見的病原菌大腸桿菌為例，通過觀察其形貌變化來研究納米N-TiO2噴劑的滅菌過程。

SEM觀察可知，在光催化殺菌過程中菌體發生了較大的形態改變。這是由于納米N-TiO2噴劑在光照下產生的羥基自由基、超氧自由基、雙陽水等活性氧物質攻擊細菌，使構成細菌細胞壁和細胞膜的有機物受到氧化。隨著光催化處理時間的增長，觀察到菌體表面出現了開放性的破損與孔洞，細胞外層結構被破壞。部分細菌的結構已完全崩塌。結合圖1-4可認為細胞內部物質出現了聚縮或流失，從而在制樣脫水與干燥過程中使得細菌出現皺縮與凹陷。反應過程中外層細胞壁與膜結構由完整到逐漸分解破損，并最終解體。

TEM觀察可知，在納米N-TiO2抗菌噴劑光催化殺菌過程中，細胞壁與細胞膜結構受到活性氧基團的氧化攻擊，細胞的屏障結構破壞，通透性發生改變，胞內K+等流失，環境中的活性氧集團與一些其他離子可進入細胞內進行進一步的反應。當細胞表面出現較大的破損時，細胞內大分子物質及內容物流失。

本次實驗以口腔科診室環境作為研究對象，進行了可見光催化納米N-TiO2噴劑抗菌材料在醫院實際環境消毒效果的評價研究，可知消毒效果顯著，初步建立了納米N-TiO2噴劑在醫院環境消毒的應用方法。但是作為一種新型抗菌劑，目前還未處于研究階段，能否廣泛應用于醫院中其他科室環境，還需進一步擴大實驗范圍；此外，能否實現全天候條件下的抗菌效果，還需將噴劑與其他抗菌材料復合得知。