基于網絡藥理學的血必凈治療H1N1病毒引起的肺微血管滲漏的潛在機制

韓甜甜 李丹華 劉小虹 詹少峰 江勇

摘要?目的：探討血必凈注射液干預肺微血管滲漏輔助治療H1N1病毒性肺炎的潛在藥理作用機制。方法：收集血必凈注射液中的活性成分，反向預測潛在作用靶點。從GeneCards數據庫中獲得疾病相關靶點。使用Venny工具對藥物及疾病的潛在靶點進行交集分析，并對交集靶點進行蛋白質-蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建。利用DAVID和京都基因和基因組百科全書（KEGG）數據庫進行通路注釋，采用Cytoscape軟件構建“中藥-活性成分-靶點-疾病”網絡模型。結果：共篩選出25個活性分子，通過調控TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3、JUN等關鍵基因，影響核因子κB信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路、細胞凋亡信號轉導途徑、血管內皮生長因子信號通路和Toll樣受體信號轉導途徑等91條通路發揮抗炎、調節免疫等作用。結論：本研究明確了血必凈注射液抗炎和調節免疫作用的物質基礎，為進一步闡釋血必凈注射液干預肺微血管滲漏輔助治療H1N1病毒性肺炎相關機制提供科學依據。

關鍵詞?血必凈注射液;H1N1病毒;肺微血管滲漏;內皮細胞;潛在機制;內皮屏障;網絡藥理學;病毒性肺炎

Abstract?Objective：To explore the potential pharmacological mechanism of Xuebijing injection in the intervention of pulmonary microvascular leakage in the adjuvant treatment of H1N1 viral pneumonia.Methods：Active ingredients in Xuebijing injection were collected，and the potential targets were prediected.Disease-related targets were obtained from the Genecards database.The Venny tool was used to analyze the intersection of potential targets of drugs and diseases，and a PPI network for the intersection targets was constructed.DAVID and KEGG databases were retrieved for pathway annotation，using Cytoscape software to construct a network model of “Chinese medicine-active ingredients-targets-disease”.Results：A total of 25 active molecules were screened out，which can regulate key genes of TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3 and JUN to affect 91 pathways，including the NF-κB signaling pathway，HIF-1 signaling pathway，and TTR，apoptosis signaling pathway，vascular endothelial growth factor signaling pathway，and Toll-like receptor signaling pathway，with anti-inflammatory and immune regulation functions.Conclusion：This study clarifies the material basis of Xuebijing injection′s anti-inflammatory and immune regulation effects，and provides a scientific basis for further elucidating the mechanism of Xuebijing injection′s intervention in pulmonary microvascular leakage adjuvant treatment of H1N1 viral pneumonia.

Keywords?Xuebijing injection; H1N1; Pulmonary microvascular leakage; Endothelial cells; Potential mechanism; Endothelial barrier; Network pharmacology; Viral pneumonia

中圖分類號：R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.22.006

自1918年西班牙流感大流行以來，流感病毒感染一直是全球健康關注的問題[1]。2009年由一種新型的甲型H1N1流感病毒引起“墨西哥流感大流行”，波及全球214個國家和地區，死亡人數超過290 000人，其中201 000人死于呼吸衰竭[2]。H1N1病毒擴散到下呼吸道，則會導致病毒性肺炎，進而可發展為急性呼吸窘迫綜合征（Acute Respiratory Distress Syndrome，ARDS）以及急性肺損傷（Acute Lung Injury，ALI），即肺微血管滲漏增加導致肺水腫、低氧血癥和呼吸衰竭的綜合征[3]?，F代研究表明，肺內皮屏障功能的喪失是ARDS和ALI中形成肺水腫等的關鍵因素。而H1N1病毒可以對肺內皮細胞產生直接和間接的影響，激活和誘導內皮使肺內皮屏障功能障礙，從而導致微血管泄漏。這些發現增加了增強肺內皮屏障完整性或調節肺內皮激活，可能被證明對嚴重流感具有治療作用的可能性[4-5]。防治肺微血管滲漏可作為重癥流感的治療靶標。

血必凈注射液是由丹參、紅花、川芎、赤芍、當歸組成的復方制劑，具有活血化瘀、清熱涼血、潰散毒邪的作用[6-7]?，F代醫學研究證明，其具有降低炎癥介質水平、調節免疫、抗氧化應激反應、降低血管內皮細胞損害以及改善微循環等作用。對輔助治療重癥肺炎具有良好的臨床療效[8-10]。

因復方中藥物成分繁雜龐大，且其多成分、多靶點、散彈式綜合治療的特點使得傳統的圍繞單體進行有效成分篩選的工作難以實現[11]。隨著學科交叉和創新思路的發展，網絡藥理學的提出與應用，從整體和分子水平為研究中藥提供了新的且可行的理論和方法。其從網絡生物學角度，在理解“疾病-靶點-藥物”相互作用網絡的基礎上，通過計算、分析、建模方法，來觀察藥物對藥理網絡的干預與影響[12-14]。因此運用網絡藥理學對血必凈活性成分進行鑒定與篩選，活性成分靶標確認和藥理學分子機制研究更切合中藥的實際情況。探索血必凈注射液干預肺微血管滲漏輔助治療H1N1病毒性肺炎的物質基礎和作用機制，為臨床應用提供理論參考。

1?材料與方法

1.1?收集活性成分?利用中國期刊全文數據庫（CJFD）、中國學術期刊數據庫（CSPD）、中文科技期刊數據庫（CCD），通過檢索“血必凈注射液有效成分”關鍵詞，收集血必凈注射液中活性成分，從CAS數據庫中確定活性成分的化學結構，再通過PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫，下載該活性成分的2D結構圖，利用Swiss Target Prediction（http：//www.swisstargetprediction.ch/）數據庫反向預測對應的靶點。

1.2?肺微血管滲漏相關靶點的篩選及其與血必凈注射液共有潛在靶點的篩選?以“Pulmonary Microvascular Leakage Caused by H1N1”作為關鍵詞，在GeneCards（https：//www.genecards.org）數據庫進行檢索及篩選。通過Venny2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），獲得血必凈活性成分靶點與疾病靶點的交集，并通過Cytoscape 3.7.1軟件構建活性成分-靶點-疾病網絡圖。

1.3?蛋白質-蛋白質相互作用網絡構建以及關鍵功能團篩選?利用STRING平臺（https：//string-db.org/）構建蛋白質-蛋白質相互作用（Protein Protein Interaction，PPI）網絡，再利用Cytoscape 3.7.1軟件對結果進行網絡拓撲屬性分析并篩選關鍵功能團。

1.4?富集分析?通過DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp）數據庫對上述預測得到的關鍵靶點信息進行基因本體（Gene Ontology，GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書（https：//www.genome.jp/kegg/，Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，得到相關生物學及通路信息。根據KEGG網站上的通路信息及相關文獻，對通路進行解釋。

2?結果

2.1?活性成分的篩選?共收集血必凈注射液活性成分25個。見表1。

2.2?中藥-活性成分-靶點-疾病網絡?根據SwissTargetPrediction數據庫中的對應靶點共搜索出25個相關化學成分對應的674個相關靶點，從GeneCards數據庫中得到疾病相關的靶點107個，通過Venny軟件，取得疾病與活性成分相關靶點基因交集，得到37個交集基因。見圖1。通過Cytoscape 3.7.1構建“中藥-活性成分-靶點-疾病”網絡。見圖2。該網絡圖由37個基因、25個藥物活性成分、1中藥物和1種疾病組成，而每條邊則表示化合物與靶點之間的相互作用關系。該圖體現出一個藥物包括多種活性成分，一種成分可以對應多個靶點，反過來一個靶點也可以對應多種成分，直觀地表明中藥復方多成分、多靶點的特點。根據度值排序，咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸A在網絡中的關聯度較高。

2.3?PPI網絡及核心功能團?為了更直觀地了解血必凈注射液干預血管滲漏的作用機制，明確靶點和靶點間作用關系。將37個交集基因輸入到STRING數據庫進行分析，物種選擇“Homo sapiens”，網絡中共包含37個節點，346條邊，平均節點度值18.7的網絡圖。節點表示靶標蛋白，邊表示蛋白與蛋白相互作用關系。見圖3。導出TSV格式文件，信息導入Cytoscape 3.7.1軟件繪制核心靶點網絡圖，并對網絡進行分析。見圖4中TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3、JUN度值顯著高于其他靶點，在PPI網絡中起十分重要的作用。

2.4?GO富集分析及KEGG富集分析?對37個交集基因進行分子功能（Molecular Function），生物過程（Biological Process）、細胞組成（Cellular Component）以及信號通路進行相關分析及注解，獲得91條相關信號通路。利用DAVID數據庫中的功能注釋工具對37個交集靶點靶點進行GO富集分析，根據P<0.05獲得靶點基因的生物學過程、細胞組分和分子功能共1 570條信息。其中生物過程（BP）條目1 444個，細胞組分（CC）條目40個，分子功能（MF）條目86個。見圖6。生物過程主要涉及凋亡反應、藥物反應等，細胞組成主要涉及細胞膜、細胞外空間等方面，分子功能主要涉及蛋白結合、相似蛋白結合、蛋白磷酸酶結合等方面。共篩選出排名前6位的GO條目。見圖5，表2。對篩選出的潛在靶點蛋白進行KEGG通路富集分析，共獲得（P<0.05）獲得91重要通路，主要在影響核因子κB信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路、細胞凋亡信號轉導途徑、血管內皮生長因子信號通路和Toll樣受體信號轉導途徑中富集。根據P值從大到小選取前30條通路。見圖6。

3?討論

內皮細胞是肺內最豐富的細胞類型，占細胞總數的30%。在肺泡中，內皮細胞排列在形成肺泡壁網絡的毛細血管上。在內皮細胞的頂端，內皮細胞與循環血液直接接觸，并形成吸收的炎癥細胞的附著部位[15]。內皮細胞經適當活化后，表達細胞黏附分子，黏附分子與白細胞上的同源配體結合，介導白細胞外滲。在基底外側，內皮細胞位于基底膜上，基底膜與上皮基底膜緊密相連（甚至與上皮基底膜融合）[16]。這種親密接觸表明內皮細胞受到來自肺泡腔上皮細胞和炎癥細胞釋放的信號和病毒顆粒的強烈影響。通過這些信號和病毒顆粒激活內皮細胞是介導對甲型流感有效免疫反應的關鍵。然而，內皮細胞的活化可能在內皮屏障的損傷中起一定作用，并導致肺水腫[17]。

流感病毒誘導肺內皮致血管通透性增加有多種機制，主要為以下3種：1）流感病毒可感染內皮細胞，誘導內皮細胞死亡，從而損傷內皮屏障;2）誘導內皮細胞產生過量的細胞因子，一方面能夠直接損傷內皮細胞，另一方面會招募嗜中性粒細胞和巨噬細胞誘導內皮屏障損傷[18];3）流感病毒感染誘導產生的細胞因子和其他炎癥介質導致細胞骨架重塑，內皮細胞與細胞之間連接的破壞，同時也可導致黏附分子的上調，從而促進白細胞的募集[19]。

本研究借助網絡藥理學的方法探討了血必凈注射液分別通過抗炎，調節血管內皮凋亡途徑達到治療由H1N1病毒引起肺微血管滲漏的藥理作用機制。研究結果提示血必凈注射液可能作用于TP53、VEGFA、EGFR、TNF、TLR4、CASP3、JUN等關鍵基因發揮作用的，分析中藥-活性成分-靶點-疾病網絡圖發現，咖啡酸、阿魏酸、丹酚酸A等化合物在網絡中的關聯度較高。進一步GO和KEGG富集分析表明37個潛在靶點與核因子κB信號通路、HIF-1信號通路、T細胞受體信號通路、細胞凋亡信號轉導途徑、血管內皮生長因子信號通路和Toll樣受體信號轉導途徑相關。提示血必凈注射液可能通過這些通路起到治療作用。

流感病毒感染的治療通常是以支持治療為主。大多數感染病毒的患者會出現典型的流感癥狀，并在一周內完全康復，不需要抗病毒治療[20]?；加袊乐丶膊』蚝粑腊Y狀較輕的患者，應使用神經氨酸酶（NA）抑制劑：多數情況下使用奧司他韋，在奧司他韋不可用的情況下則采用霧化扎納米韋或靜脈內注射帕西韋進行治療[21]。在嚴重疾病的情況下，可以考慮使用更大劑量的奧司他韋和更長的治療時間。包括肺保護通氣和NA抑制劑在內的支持性措施是治療嚴重流感導致呼吸衰竭和ARDS的主要手段。然而在研究治療策略時，重要的是要考慮在感染病毒致更嚴重的病毒性肺炎甚至是出現嚴重肺損傷之前，對患者進行干預、增強肺內皮屏障完整性或調節肺內皮激活治療。因此，防治肺微血管滲漏可作為重癥流感的治療靶標[22-23]。

綜上所述，應用網絡藥理學方法對血必凈注射液的活性成分、潛在靶點、潛在通路進行了分析，從分子水平闡述了血必凈注射液對機體進行調控的過程，為血必凈注射液干預肺微血管滲漏輔助治療流感病毒性肺炎提供了理論依據。當然，沒有通過具體的實驗驗證，因此存在一定的局限性，有待進一步通過相關研究加以證實。

參考文獻

[1]Chow EJ，Doyle JD，Uyeki TM.Influenza virus-related critical illness：prevention，diagnosis，treatment[J].Crit Care，2019，23（1）：214.

[2]Ding Z，Sun G，Zhu Z.Hesperidin attenuates influenza A virus（H1N1） induced lung injury in rats through its anti-inflammatory effect[J].Antivir Ther，2018，23（7）：611-615.

[3]Kalil AC，Thomas PG.Influenza virus-related critical illness：pathophysiology and epidemiology[J].Crit Care，2019，23（1）：258.

[4]Daoud A，Laktineh A，Macrander C，et al.Pulmonary complications of influenza infection：a targeted narrative review[J].Postgrad Med，2019，131（5）：299-308.

[5]Kim KS，Jung H，Shin IK，et al.Induction of interleukin-1 beta（IL-1β） is a critical component of lung inflammation during influenza A（H1N1） virus infection[J].J Med Virol，2015，87（7）：1104-1112.

[6]易艷，李春英，張宇實，等.血必凈注射液類過敏反應及合理用藥方法[J].中國實驗方劑學雜志，2021，27（5）：77-83.

[7]Song Y，Yao C，Yao Y，et al.XueBiJing Injection Versus Placebo for Critically Ill Patients With Severe Community-Acquired Pneumonia：A Randomized Controlled Trial[J].Crit Care Med，2019，47（9）：e735-e743.

[8]Sugiyama MG，Gamage A，Zyla R，et al.Influenza Virus Infection Induces Platelet-Endothelial Adhesion Which Contributes to Lung Injury[J].J Virol，2016，90（4）：1812-1823.

[9]Lobo SM，Watanabe A，Salomo M，et al.Excess mortality is associated with influenza A（H1N1） in patients with severe acute respiratory illness[J].J Clin Virol，2019，116：62-68.

[10]滕寅，肖家榮，林鵬，等.血必凈注射液對重癥肺炎患者細胞免疫及炎癥因子的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2012，18（17）：295-297.

[11]Raudvere U，Kolberg L，Kuzmin I，et al.g：Profiler：a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists（2019 update）[J].Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W191-W198.

[12]Herold S，Becker C，Ridge KM，et al.Influenza virus-induced lung injury：pathogenesis and implications for treatment[J].Eur Respir J，2015，45（5）：1463-1478.

[13]Raudvere U，Kolberg L，Kuzmin I，et al.g：Profiler：a web server for functional enrichment analysis and conversions of gene lists（2019 update）[J].Nucleic Acids Res，2019，47（W1）：W191-W198.

[14]Wang C，Armstrong SM，Sugiyama MG，et al.Influenza-Induced Priming and Leak of Human Lung Microvascular Endothelium upon Exposure to Staphylococcus aureus[J].Am J Respir Cell Mol Biol，2015，53（4）：459-470.

[15]Short KR，Kasper J，van der Aa S，et al.Influenza virus damages the alveolar barrier by disrupting epithelial cell tight junctions[J].Eur Respir J，2016，47（3）：954-966.

[16]Yu WY，Li L，Wu F，et al.Moslea Herba flavonoids alleviated influenza A virus-induced pulmonary endothelial barrier disruption via suppressing NOX4/NF-κB/MLCK pathway[J].J Ethnopharmacol，2020，253：112641.

[17]Wang L，Jiang H，Shen SM，et al.Inhibition of autophagy and chemokine induction by sphingosine 1-phosphate receptor 1 through NF-κB signaling in human pulmonary endothelial cells infected with influenza A viruses[J].PLoS One，2018，13（10）：e0205344.

[18]Kwok HH，Poon PY，Fok SP，et al.Anti-inflammatory effects of indirubin derivatives on influenza A virus-infected human pulmonary microvascular endothelial cells[J].Sci Rep，2016，6：18941.

[19]Chanthick C，Suttitheptumrong A，Rawarak N，et al.Transcytosis Involvement in Transport System and Endothelial Permeability of Vascular Leakage during Dengue Virus Infection[J].Viruses，2018，10（2）：69.

[20]Anupriya MG，Singh S，Hulyalkar NV，et al.Sphingolipid signaling modulates trans-endothelial cell permeability in dengue virus infected HMEC-1 cells[J].Prostaglandins Other Lipid Mediat，2018，136：44-54.

[21]Gorbunova EE，Simons MJ，Gavrilovskaya IN，et al.The Andes Virus Nucleocapsid Protein Directs Basal Endothelial Cell Permeability by Activating RhoA[J].mBio，2016，7（5）：e01747-16.

[22]Zhuang Z，Xiao-qin，Hu H，et al.Down-regulation of microRNA-155 attenuates retinal neovascularization via the PI3K/Akt pathway[J].Mol Vis，2015，21：1173-1184.

[23]Suo J，Zhao L，Wang J，et al.Influenza virus aggravates the ox-LDL-induced apoptosis of human endothelial cells via promoting p53 signaling[J].J Med Virol，2015，87（7）：1113-1123.

（2020-11-19收稿?責任編輯：魏慶雙）